S.N. Elansky, L.Yu. Kokaeva, N.V. Statsyuk, Yu.T. Dyakov
Giới thiệu
Oomycete Phytophthora infestans (Mont.) De Bary, tác nhân gây bệnh mốc sương, bệnh kinh tế quan trọng nhất trên khoai tây và cà chua, đã thu hút sự chú ý của các nhà nghiên cứu từ các quốc gia khác nhau trong hơn một thế kỷ rưỡi. Bất ngờ xuất hiện ở châu Âu vào giữa thế kỷ XNUMX, nó đã gây ra đại dịch khoai tây mà đến nay vẫn còn trong ký ức của nhiều thế hệ.
Cho đến nay, nó thường được gọi là "nấm của cơn đói Ireland". Gần một trăm năm sau vụ dịch bệnh đầu tiên, các loài khoai tây hoang dã của Mexico kháng bệnh mốc sương được phát hiện, các phương pháp lai chúng với khoai tây trồng trọt đã được phát triển (Muller, 1935), và các giống khoai tây kháng bệnh mốc sương đầu tiên đã thu được (Pushkarev, 1937). Tuy nhiên, ngay sau khi bắt đầu trồng đại trà, các chủng loại mầm bệnh mốc sương có độc lực đối với các giống kháng bệnh đã tích lũy. và việc đưa các gen kháng mới từ khoai tây Mexico hoang dã vào các giống bắt đầu nhanh chóng mất hiệu quả.
Những thất bại trong việc sử dụng kháng đơn gen (dọc) buộc các nhà lai tạo phải tìm kiếm những cách thức phức tạp hơn để khai thác tính kháng đa gen (ngang) không đặc hiệu. Trong những năm gần đây, các chủng tộc hung hãn đã bắt đầu tích tụ trong các quần thể ký sinh trùng riêng lẻ, gây ra sự xói mòn sức đề kháng thậm chí không đặc hiệu. Sự ra đời của các chủng kháng thuốc trừ nấm đã gây ra nhiều vấn đề trong việc sử dụng hóa chất bảo vệ khoai tây.
Do sự khác biệt đáng kể giữa oomycetes và nấm về thành phần hóa học, siêu cấu trúc và sự trao đổi chất, thuốc diệt nấm, đặc biệt là những loại dùng toàn thân được sử dụng để bảo vệ thực vật khỏi nhiều bệnh nấm, không có hiệu quả đối với oomycetes.
Vì vậy, trong việc bảo vệ hóa học chống lại bệnh mốc sương, người ta đã sử dụng phun nhiều lần (tối đa 12 lần mỗi mùa hoặc hơn) với các chế phẩm tiếp xúc có phổ tác dụng rộng. Một bước tiến mang tính cách mạng là việc sử dụng phenylamit, chất độc đối với tế bào trứng và lây lan có hệ thống trong thực vật. Tuy nhiên, việc sử dụng rộng rãi chúng nhanh chóng dẫn đến sự tích tụ các chủng kháng thuốc trong quần thể nấm (Davidse và cộng sự, 1981), điều này làm phức tạp đáng kể việc bảo vệ thực vật. P. infestans trên thực tế là loài ký sinh duy nhất của vùng ôn đới, tác hại của nông nghiệp hữu cơ không thể được hóa giải nếu không sử dụng các biện pháp bảo vệ bằng hóa chất (Van Bruggen, 1995).
Những điều trên giải thích sự chú ý to lớn của các nhà nghiên cứu từ các quốc gia khác nhau đối với việc nghiên cứu các quần thể P. infestans, động lực của sự phong phú và thành phần di truyền của chúng, cũng như các cơ chế di truyền của sự biến đổi.
Vòng đời của R. INFESTANS
Oomycete Phytophthora infestans phát triển một sợi nấm gian bào với các lông tơ bên trong lá khoai tây. Ăn vào các mô lá, nó gây ra sự hình thành các đốm đen, chuyển sang màu đen và thối rữa khi thời tiết ẩm ướt. Với một thất bại mạnh mẽ, toàn bộ lá sẽ chết. Sau một thời gian cho ăn, các mầm non được hình thành trên các sợi nấm - tế bào bào tử - phát triển ra ngoài qua khí khổng. Trong thời tiết ẩm ướt, chúng hình thành một bông hoa màu trắng xung quanh các đốm ở mặt dưới của lá. Ở cuối các túi bào tử, các túi bào tử hình quả chanh được hình thành, chúng vỡ ra và được mang theo khi mưa phun (Hình 1). Rơi thành giọt nước trên bề mặt lá khoai, túi bào tử nảy mầm với 6 - 8 động bào tử, sau một thời gian di chuyển sẽ tròn lại, có vỏ và nảy mầm bằng ống mầm. Mầm xuyên qua khí khổng vào mô lá. Trong những điều kiện nhất định, túi bào tử có thể phát triển trong ống sinh trưởng trực tiếp vào mô lá. Trong điều kiện thuận lợi, thời gian từ khi lây nhiễm đến khi hình thành bào tử mới chỉ từ 3 - 4 ngày.
Khi ở trên mặt đất và được lọc qua đất, các túi bào tử có khả năng lây nhiễm cho củ. Các củ bị ảnh hưởng nặng bị thối rữa trong quá trình bảo quản; ở những người bị ảnh hưởng yếu, nhiễm trùng có thể tồn tại cho đến mùa tiếp theo. Ngoài ra, tác nhân gây bệnh mốc sương có thể tồn tại trong mùa đông dưới dạng bào tử trứng (bào tử sinh dục nghỉ ngơi có vách dày) trong đất trên mảnh vụn thực vật và trên hạt cà chua. Bào tử được hình thành trên các cơ quan sống của thực vật khi các chủng loại khác nhau giao phối gặp ẩm ướt quá mức. Vào mùa xuân, bào tử vô tính được hình thành trên các củ bị nhiễm bệnh đã trồng và trên tàn dư thực vật có bào tử; bào tử động vật xâm nhập vào đất và gây nhiễm các lá phía dưới của cây. Trong một số trường hợp, sợi nấm có thể phát triển từ củ bị nhiễm bệnh dọc theo phần xanh của cây và thường xuất hiện ở phần trên của thân cây.
Một sự khác biệt đáng kể giữa oomycetes và hầu hết các loại nấm nằm ở ưu thế của diplophase trong vòng đời của chúng với quá trình meiosis giao tử và sự nảy mầm của hợp tử (bào tử) mà không có sự phân hạch nhân giảm phân. Đặc điểm này, cộng với dị nguyên lưỡng cực, thay thế cho lưỡng tính, dường như có thể áp dụng cho oomycetes mà các phương pháp tiếp cận được phát triển để nghiên cứu quần thể sinh vật nhân thực bậc cao (phân tích panmixia và chia nhỏ quần thể, dòng gen trong và giữa quần thể, v.v.). Tuy nhiên, ba yếu tố không cho phép chuyển giao hoàn toàn những cách tiếp cận này trong nghiên cứu quần thể P. infestans.
1. Cùng với bào tử lai, các bào tử sinh sản tự sinh và di truyền gen được hình thành trong quần thể (Fife và Shaw, 1992; Anikina và cộng sự, 1997a; Savenkova, Cherepnikoba-Anirina, 2002; Smirnov, 2003), và tần suất hình thành của chúng có thể đủ để ảnh hưởng vào kết quả kiểm tra.
2. Quá trình hữu tính ở P. infestans đóng góp không đáng kể vào động thái của kích thước quần thể, vì nấm sinh sản chủ yếu bằng bào tử sinh dưỡng, chiếm hơn 90% kết quả phân tích kiểu giao phối theo phương pháp truyền thống trên môi trường dinh dưỡng. ... mùa sinh trưởng là vài thế hệ sinh bào tử vô tính (bệnh đa vòng phát triển). Bào tử đóng một vai trò quan trọng trong việc bảo tồn sinh vật trong thời kỳ không có cây xanh (trong mùa đông) và trong quá trình lây nhiễm sơ cấp của cây con. Sau đó, trong mùa hè, sự sinh sản vô tính xảy ra và sự gia tăng hoặc ngược lại, sự giảm số lượng cá thể vô tính phát sinh do kết quả của sự tái tổ hợp hữu tính, chủ yếu được xác định bởi việc chọn lọc những con thích nghi hơn. Vì vậy, tỷ lệ các cá thể vô tính trong một quần thể ở thời điểm bắt đầu và kết thúc biểu sinh có thể hoàn toàn khác nhau.
3. Chu kỳ được mô tả là đặc trưng của quần thể P. infestans bản địa ở quê hương của chúng, Trung Mỹ. Ở các khu vực khác trên thế giới, quá trình hữu tính không được biết đến trong hơn 100 năm; sợi nấm sinh dưỡng trong củ khoai tây bị nhiễm bệnh là giai đoạn đông lạnh. Vòng đời hoàn toàn trầm trọng, và sự lây lan có tính chất tập trung: sự lây nhiễm từ những củ cây trồng bị nhiễm bệnh đơn lẻ truyền sang lá, tạo thành những ổ bệnh chính, có thể kết hợp với sự phát triển ồ ạt của bệnh.
Do đó, ở một số vùng có thể có sự luân phiên của các chu kỳ sinh dục và vô tính, trong khi ở những vùng khác - chỉ có chu kỳ vô tính.
Nguồn gốc của P. INFESTANS
P. infestans xuất hiện ở châu Âu vào cuối nửa đầu thế kỷ 1991. Vì khoai tây có nguồn gốc từ đông bắc Nam Mỹ, người ta cho rằng ký sinh trùng đã được mang từ đó đến châu Âu trong thời kỳ bùng nổ của loài cá muối Chile. Tuy nhiên, các nghiên cứu được thực hiện tại trạm khoai tây Trung tâm Rockefeller ở Thung lũng Toluca, Mexico đã buộc quan điểm này phải được xem xét lại (Niederhauser, 1993, XNUMX).
1. Ở Thung lũng Toluca, các loài khoai tây có củ địa phương (Solanum demissum, S. bulbocastanum, v.v.) có các bộ gen khác nhau về tính kháng dọc kết hợp với mức độ kháng không đặc hiệu cao, điều này cho thấy sự đồng tiến hóa lâu dài với ký sinh trùng. Các loài ở Nam Mỹ, bao gồm cả khoai tây trồng trọt, thiếu gen kháng thuốc.
2. Ở Thung lũng Toluca, có các chủng phân lập với kiểu giao phối A1 và A2, kết quả là quần thể lai giữa P. infestans được phổ biến rộng rãi; trong khi ở quê hương của khoai tây được trồng, Nam Mỹ, ký sinh trùng lây lan vô tính.
3. Ở Thung lũng Toluca, hàng năm có dịch bệnh mốc sương nghiêm trọng. Do đó, giữa các nhà nghiên cứu Bắc Mỹ (Đại học Cornell), quan điểm về Mesoamerica (Trung Mỹ) là nơi sinh của thực vật khoai tây được thiết lập (Goodwin và cộng sự, 1994).
Các nhà nghiên cứu Nam Mỹ không chia sẻ ý kiến này. Họ tin rằng khoai tây được trồng và ký sinh trùng P. infestans có một quê hương chung - dãy núi Andes Nam Mỹ. Họ ủng hộ quan điểm của mình bằng các nghiên cứu phân tử về phân tích đa hình DNA của bộ gen ty thể (mtDNA) và gen nhân RAS và β-tubulin (Gomez-Alpizar và cộng sự, 2007). Họ chỉ ra rằng các chủng được thu thập từ các khu vực khác nhau trên thế giới có nguồn gốc từ ba dòng tổ tiên khác nhau (cả ba) đều được tìm thấy ở dãy núi Andes Nam Mỹ. Các loài đơn bội Andean là hậu duệ của hai dòng: các dòng phân lập của dòng mtDNA lâu đời nhất được tìm thấy trên cây Solanaceae mọc hoang từ phần Anarrhicomenum ở Ecuador, trong khi các dòng phân lập của dòng thứ hai phổ biến trên khoai tây, cà chua và bọ hung đêm. Ở Toluca, ngay cả những loài đơn bội hiếm cũng chỉ xuất phát từ một dòng dõi, với sự biến đổi di truyền của các chủng Toluca (tần số alen thấp của một số vị trí biến đổi) cho thấy một hiệu ứng người sáng lập mạnh mẽ do sự trôi dạt gần đây.
Ngoài ra, một loài mới P. andina đã được tìm thấy ở dãy Andes, giống về mặt hình thái và di truyền với P. infestans, theo các tác giả, chỉ ra dãy Andes là một điểm đặc biệt nóng của chi Phytophthora. Cuối cùng, ở châu Âu và Hoa Kỳ, quần thể P. Infestans bao gồm cả hai dòng dõi Andean, trong khi ở Toluca chỉ có một.
Công bố này đã thúc đẩy phản hồi từ một nhóm các nhà nghiên cứu từ các quốc gia khác nhau, những người đã thực hiện rất nhiều công việc thử nghiệm để sửa đổi nghiên cứu đã thực hiện trước đó (Goss và cộng sự, 2014). Trong công trình này, trước tiên, các trình tự DNA microatellite có nhiều thông tin hơn đã được sử dụng để nghiên cứu đa hình DNA; thứ hai, để phân tích sự phân cụm, các con đường di cư, sự phân hóa theo thời gian của các quần thể, v.v. các mô hình tiên tiến hơn đã được sử dụng (thống kê F, xấp xỉ Bayes, v.v.) và thứ ba, một phép so sánh không chỉ được sử dụng với loài P. andina ở Andean, trong đó một bản chất lai được thiết lập (P. infestans x Phytophthora sp.) mà còn với các loài đặc hữu của Mexico là P. mirabilis, P. Ipomoeae và Phytophthora phaseoli, những loài P. infestans gần gũi về mặt di truyền được đưa vào cùng một nhánh (Kroon và cộng sự, 2012). Kết quả của những phân tích này, rõ ràng đã chỉ ra rằng phần rễ của cây phát sinh loài của tất cả các loài thuộc chi Phytophthora được đưa vào nghiên cứu, ngoại trừ P. andina lai, thuộc các chủng Mexico, và dòng di cư có hướng Mexico - Andes, chứ không phải ngược lại, và phần đầu của nó trùng với hướng Châu Âu thuộc địa của Tân Thế giới (300-600 năm trước). Do đó, sự xuất hiện của loài P. infestans chuyên để đánh bại khoai tây đã xảy ra ở trung tâm di truyền thứ cấp của quá trình hình thành các cây thân củ, tức là ở Trung Mỹ.
Bộ gen của P. INFESTANS
Năm 2009, một nhóm các nhà khoa học quốc tế đã giải mã trình tự bộ gen hoàn chỉnh của P infestans (Haas và cộng sự, 2009), kích thước của bộ gen đó là 240 MB. Con số này nhiều hơn nhiều lần so với các loài có họ hàng gần P. sojae (95 Mb), gây thối rễ đậu nành và P. Ramorum (65 Mb), ảnh hưởng đến các loài cây có giá trị như sồi, sồi và một số loài khác. Dữ liệu thu được cho thấy bộ gen chứa một số lượng lớn các bản sao của các trình tự lặp lại - 74%. Bộ gen chứa 17797 gen mã hóa protein, hầu hết là gen liên quan đến các quá trình tế bào, bao gồm sao chép DNA, phiên mã và dịch mã protein.
So sánh các bộ gen của chi Phytophthora cho thấy một tổ chức bất thường của bộ gen, bao gồm các khối trình tự của các gen được bảo tồn, trong đó mật độ gen tương đối cao và hàm lượng các trình tự lặp lại tương đối thấp, và các vùng riêng lẻ có trình tự gen không được bảo tồn có mật độ gen thấp và hàm lượng các vùng lặp lại cao. Các khối bảo tồn chiếm 70% (12440) của tất cả các gen mã hóa protein của P. infestans. Trong các khối bảo tồn, các gen thường nằm gần nhau với khoảng cách giữa các gen trung bình là 604 bp. Trong các khu vực giữa các khối bảo tồn, khoảng cách giữa các gen lớn hơn (3700 bp) do sự gia tăng mật độ của các phần tử lặp lại. Các gen tiết ra hiệu ứng tiến hóa nhanh nằm ở các vùng nghèo gen.
Phân tích trình tự của bộ gen P. Infestans cho thấy khoảng một phần ba bộ gen thuộc về các yếu tố có thể chuyển vị. Bộ gen của P. infestans chứa nhiều họ transposon khác nhau đáng kể so với các bộ gen đã biết khác. Hầu hết P. infestans transposon thuộc gia đình giang hồ.
Một số lượng lớn các họ gen cụ thể liên quan đến quá trình sinh bệnh đã được xác định trong bộ gen của P. infestans. Một phần đáng kể trong số chúng mã hóa các protein tác động làm thay đổi tính chất sinh lý của cây chủ và góp phần vào sự lây nhiễm của nó. Chúng được chia thành hai loại lớn: tác nhân gây apoplastic, hoạt động trong khoảng gian bào (apoplasts) và tác động tế bào chất, xâm nhập vào tế bào thông qua haustoria. Các tác nhân gây hiệu ứng apoplastic bao gồm các enzym thủy phân được tiết ra như protease, lipase và glycosylase phá hủy tế bào thực vật; chất ức chế các enzym bảo vệ thực vật ký chủ; và các chất độc gây hoại tử như protein giống Nep1 (NPL) và protein nhỏ giàu cysteine (SCR) giống Pcf.
Các gen tác động của P. infestans rất nhiều và thường lớn hơn các gen không gây bệnh. Nổi tiếng nhất là các hiệu ứng tế bào chất RXLR và Crinkler (CNR). Các tác nhân gây hiệu ứng tế bào chất điển hình của oomycetes là các protein RXLR. Tất cả các gen hiệu ứng RXLR được phát hiện cho đến nay đều chứa nhóm đầu tận cùng amin Arg-XLeu-Arg, trong đó X là một axit amin. Kết quả của nghiên cứu, người ta cho rằng có 563 gen RXLR trong bộ gen của P. infestans, nhiều hơn 60% so với P. sojae và P. ramorum. Khoảng một nửa số gen RXLR trong bộ gen của P. infestans là dành riêng cho loài. Hiệu ứng RXLR có nhiều chuỗi khác nhau. Trong đó, một gia đình lớn và 150 gia đình nhỏ đã được xác định. Không giống như proteome chính, các gen hiệu ứng RXLR thường nằm ở các vùng nghèo gen và giàu lặp lại của bộ gen. Các yếu tố di động xác định tính năng động của các vùng này thúc đẩy sự tái tổ hợp trong các gen này.
Các tác nhân CRN tế bào chất ban đầu được xác định trong các bản sao của P. infestans mã hóa peptit hoại tử mô thực vật. Kể từ khi họ phát hiện ra, người ta đã biết rất ít về họ của những hiệu ứng này. Phân tích bộ gen của P. Infestans cho thấy một họ khổng lồ gồm 196 gen CRN, lớn hơn nhiều so với P. sojae (100 CRN) và P. ramorum (19 CRN). Giống như RXLR, CRN là các protein mô-đun và bao gồm vùng LFLAK đầu N được bảo tồn cao (50 axit amin) và vùng DWL liền kề chứa các gen khác nhau. Hầu hết CRN (60%) sở hữu một peptide tín hiệu.
Khả năng của các CRN khác nhau làm gián đoạn các quá trình tế bào của cây chủ đã được nghiên cứu. Khi phân tích bệnh hoại tử thực vật, việc loại bỏ các protein CRN2 giúp xác định được vùng tận cùng C gồm 234 axit amin (vị trí 173-407, miền DXG) và gây chết tế bào. Phân tích các gen CRN của P. infestans cho thấy 18 vùng đầu cuối C khác nhau, các vùng này cũng gây chết tế bào trong cây. Chúng bao gồm các miền DC mới được xác định (P. Infestans có 49 gen và 2 pseudogenes), cũng như các miền D14 (43 và 2) và DBF (1 và 255) tương tự như các kinase protein. Protein của vùng CRN biểu hiện trong thực vật được bảo tồn (trong trường hợp không có peptit tín hiệu) trong tế bào thực vật và kích thích tế bào chết theo cơ chế nội bào. XNUMX trình tự khác có chứa miền CRN rất có thể không hoạt động như gen.
Sự gia tăng số lượng và kích thước của các họ gen hiệu ứng RXLR và CRN có lẽ là do sự tái tổ hợp và sao chép gen tương đồng không alen. Mặc dù thực tế là bộ gen có chứa một số lượng lớn các yếu tố di động tích cực, vẫn chưa có bằng chứng trực tiếp về việc chuyển gen tác động.
Các phương pháp nghiên cứu cơ cấu dân số
Việc nghiên cứu cấu trúc di truyền của các quần thể hiện đang dựa trên việc phân tích các mẫu cấy thuần chủng của các chủng thành phần của nó. Việc phân tích các quần thể mà không phân lập cây trồng thuần chủng cũng được thực hiện cho các mục đích cụ thể, chẳng hạn như nghiên cứu tính hiếu chiến của một quần thể hoặc sự hiện diện của các chủng kháng thuốc trừ nấm trong đó (Filippov và cộng sự, 2004; Derevyagina và cộng sự, 1999). Loại nghiên cứu này liên quan đến việc sử dụng các phương pháp đặc biệt, mô tả về phương pháp này nằm ngoài phạm vi của bài đánh giá này. Để phân tích so sánh các chủng, một số phương pháp được sử dụng dựa trên cả phân tích cấu trúc DNA và nghiên cứu các biểu hiện kiểu hình. Phân tích so sánh các quần thể phải xử lý một số lượng lớn các chủng phân lập, điều này đặt ra các yêu cầu nhất định đối với các phương pháp được sử dụng. Tốt nhất, họ nên đáp ứng các yêu cầu sau (Cooke, Lees, 2004, Mueller, Wolfenbarger, 1999):
- rẻ, dễ thực hiện, không đòi hỏi chi phí thời gian đáng kể và dựa trên các công nghệ thường có sẵn (ví dụ, PCR);
- phải tạo ra một số lượng đủ lớn các đặc điểm đánh dấu đồng chi phối độc lập;
- có khả năng tái tạo cao;
- sử dụng lượng mô tối thiểu được kiểm tra;
- đặc trưng cho chất nền (sự nhiễm bẩn có trong môi trường nuôi cấy không được ảnh hưởng đến kết quả);
- không yêu cầu sử dụng các quy trình nguy hiểm và hóa chất độc hại cao.
Thật không may, không có phương thức nào tương ứng với tất cả các tham số trên. Để nghiên cứu so sánh các chủng trong thời đại của chúng ta, các phương pháp được sử dụng dựa trên việc phân tích các đặc điểm kiểu hình: độc lực đối với các giống khoai tây và cà chua (giống khoai tây và cà chua), kiểu giao phối, phổ của peptidase isoenzyme và glucose-6-phosphate isomerase, và phân tích cấu trúc DNA: đa hình chiều dài đoạn giới hạn (RFLP), thường được bổ sung với đầu dò lai RG 57, phân tích số lần lặp lại của tế bào micro (SSR và InterSSR), khuếch đại với mồi ngẫu nhiên (RAPD), khuếch đại đoạn giới hạn (AFLP), khuếch đại với mồi tương đồng với trình tự của các phần tử di động (ví dụ: SINE PCR), xác định các kiểu đơn bội DNA ty thể.
Mô tả ngắn gọn về các phương pháp nghiên cứu so sánh các chủng được sử dụng trong nghiên cứu với P. Infestans
Các đặc điểm đánh dấu kiểu hình
Cuộc đua "khoai tây"
Các chủng tộc "khoai tây" là một điểm đánh dấu được nghiên cứu và sử dụng phổ biến. Các chủng tộc “khoai tây đơn giản” có một gen cho độc lực của khoai tây, các chủng tộc “phức tạp” - ít nhất là hai. Black và cộng sự (1953), tổng hợp tất cả dữ liệu có sẵn cho họ, phát hiện ra rằng chủng phytophthora có khả năng lây nhiễm cho cây trồng với gen / gen kháng tương ứng với gen / gen độc lực của P. infestans, và phát hiện ra các chủng tộc 1, 2, 3 và 4 lây nhiễm cho cây với các gen R1, R2, R3 và R4 tương ứng, tức là sự tương tác giữa vật kí sinh và vật chủ xảy ra theo nguyên tắc gen đối với gen. Hơn nữa, Black, với sự tham gia của Gallegly và Malcolmson, đã khám phá ra các gen kháng thuốc R5, R6, R7, R8, R9, R10 và R11, cũng như các chủng tộc tương ứng (Black, 1954; Black & Gallegly, 1957; Malcolmson & Black, 1966; Malcolmson, 1970).
Có rất nhiều dữ liệu về thành phần chủng tộc của mầm bệnh từ các vùng khác nhau. Nếu không phân tích những dữ liệu này một cách chi tiết, chúng tôi sẽ chỉ chỉ ra một xu hướng chung: khi các giống có gen kháng mới hoặc sự kết hợp của chúng được sử dụng, lúc đầu có một số bệnh mốc sương yếu đi, nhưng sau đó các giống với các gen độc lực tương ứng xuất hiện và được chọn lọc và bùng phát bệnh mốc sương lại tiếp tục. Độc lực cụ thể đối với 4 gen kháng đầu tiên (R1-R4) hiếm khi được quan sát thấy trong các bộ sưu tập được thu thập trước khi đưa vào trồng các giống có các gen này, nhưng số lượng các chủng độc lực tăng mạnh khi mầm bệnh được ký sinh trên các giống mang các gen này. Mặt khác, gen 5-11 khá phổ biến trong các bộ sưu tập (Shaw, 1991).
Một nghiên cứu về tỷ lệ giữa các chủng tộc khác nhau trong mùa sinh trưởng, được thực hiện vào cuối những năm 1980, cho thấy vào thời điểm bắt đầu phát triển của bệnh, các dòng vô tính có tính hung hăng thấp và 1-2 gen độc lực chiếm ưu thế trong quần thể.
Hơn nữa, với sự phát triển của bệnh mốc sương, sự tập trung của các dòng vô tính ban đầu giảm và số lượng các chủng tộc "phức tạp" với tính hiếu chiến cao tăng lên. Sự xuất hiện của thứ hai vào cuối mùa giải đạt 100%. Khi bảo quản củ, tính hiếu chiến bị giảm và mất các gen độc lực riêng lẻ. Động lực thay thế dòng vô tính có thể xảy ra ở các giống khác nhau theo những cách khác nhau (Rybakova & Dyakov, 1990). Tuy nhiên, các nghiên cứu của chúng tôi vào năm 2000-2010 cho thấy rằng các chủng tộc phức tạp được tìm thấy ngay từ khi bắt đầu biểu sinh giữa các chủng phân lập từ cả khoai tây và cà chua. Điều này có thể là do những thay đổi trong quần thể P. Infestans ở Nga.
Đến năm 1988-1995, sự xuất hiện của các “siêu chủng” với tất cả hoặc gần như tất cả các gen độc lực ở các vùng khác nhau đạt 70-100%. Tình hình như vậy đã được ghi nhận, ví dụ, ở Belarus, ở vùng Leningrad, Moscow, ở Bắc Ossetia và ở Đức (Ivanyuk và cộng sự, 2002a, 2002b; Politiko, 1994; Schober-Butin và cộng sự, 1995).
Cuộc đua "cà chua"
Trong các giống cà chua, chỉ có 2 gen kháng bệnh mốc sương được tìm thấy - Ph1 (Gallegly & Marvell, 1955) và Ph2 (Al-Kherb, 1988). Như trong trường hợp của các chủng tộc khoai tây, sự tương tác giữa cà chua và P. infestans xảy ra trên cơ sở từng gen. Nòi T0 lây nhiễm các giống không có gen kháng thuốc (hầu hết các giống được sử dụng công nghiệp), nòi T1 lây nhiễm các giống có gen Ph1 (Ottawa), và nòi T2 lây nhiễm các giống có gen Ph2.
Ở Nga, hầu như chỉ tìm thấy T0 trên khoai tây; T0 chiếm ưu thế trên cà chua vào đầu vụ, nhưng sau đó nó được thay thế bởi chủng T1 (Dyakov và cộng sự, 1975, 1994). Sau năm 2000, T1 trên khoai tây ở nhiều quần thể bắt đầu xuất hiện ở giai đoạn đầu biểu sinh. Tại Hoa Kỳ, các chủng khoai tây không gây bệnh cho cà chua, cũng như các chủng T0, T1 và T2, trong khi T1 và T2 chiếm ưu thế trên cà chua (Vartanian & Endo, 1985; Goodwin et al., 1995).
Loại giao phối
Để tiến hành nghiên cứu, cần có các chủng thử nghiệm (đối chứng) với các kiểu giao phối đã biết - A1 và A2. Mẫu thử nghiệm được cấy theo cặp vào đĩa Petri với môi trường thạch yến mạch. Sau khi ủ trong 10 ngày, các đĩa được kiểm tra sự hiện diện hoặc không có bào tử trong môi trường ở vùng tiếp xúc của các chủng. Có 4 lựa chọn: chủng thuộc kiểu giao phối A1, nếu nó hình thành bào tử với người thử nghiệm A2, với A2, nếu nó tạo thành bào tử với người thử nghiệm A1, với A1A2, nếu nó tạo thành bào tử với cả hai người thử nghiệm, hoặc vô sinh (00), nếu nó không tạo thành bào tử không có người thử nghiệm (hai nhóm cuối cùng rất hiếm).
Để xác định nhanh hơn các kiểu giao phối, người ta đã cố gắng xác định các vùng của bộ gen có liên quan đến kiểu giao phối, với mục đích sử dụng chúng để xác định kiểu giao phối bằng PCR. Một trong những thí nghiệm thành công đầu tiên để xác định một địa điểm như vậy được thực hiện bởi các nhà nghiên cứu người Mỹ (Judelson và cộng sự, 1995). Sử dụng phương pháp RAPD, họ có thể xác định vùng W16 liên quan đến kiểu giao phối ở con cái của hai dòng phân lập lai và thiết kế một cặp mồi 24 bp để khuếch đại nó (W16-1 (5'-AACACGCACAAGGCATATAAATGTA-3 ') và W16-2 (5' -GCGTAATGTAGCGTAACAGCTCTC-3 ') Sau khi cho sản phẩm PCR giới hạn bằng enzym giới hạn HaeIII, người ta tách được các chủng phân lập có kiểu bắt cặp A1 và A2.
Các nhà nghiên cứu Hàn Quốc đã thực hiện một nỗ lực khác để lấy các dấu hiệu PCR để xác định kiểu giao phối (Kim, Lee, 2002). Họ đã xác định các sản phẩm cụ thể bằng phương pháp AFLP. Kết quả là, một cặp mồi PHYB-1 (thuận) (5'-GATCGGATTAGTCAGACGAG-3 ') và PHYB-2 (5'-GCGTCTGCAAGGCGCATTTT-3') đã được phát triển, cho phép khuếch đại có chọn lọc vùng gen liên kết với kiểu giao phối A2. Sau đó, họ tiếp tục công việc này và thiết kế các mồi 5 'AAGCTATACTGGGACAGGGT-3' (INF-1, chuyển tiếp) và 5'-GCGTTCTTTCGTATTACCAC-3 '(INF-2), cho phép khuếch đại chọn lọc vùng Mat-A1, đặc trưng của các chủng có kiểu giao phối A1. Việc sử dụng chẩn đoán PCR các kiểu giao phối cho kết quả tốt khi nghiên cứu quần thể P. infestans ở Cộng hòa Séc (Mazakova và cộng sự, 2006), Tunisia (Jmour, Hamada, 2006) và các vùng khác. Trong phòng thí nghiệm của chúng tôi (Mytsa, Elansky, chưa được công bố), 34 chủng P. infestans được phân lập từ các bộ phận của khoai tây và cà chua bị bệnh ở các vùng khác nhau của Nga (vùng Kostroma, Ryazan, Astrakhan và Moscow) đã được phân tích. Kết quả phân tích PCR sử dụng mồi đặc hiệu trên 90% trùng khớp với kết quả phân tích kiểu giao phối theo phương pháp truyền thống trên môi trường dinh dưỡng.
Bảng 1. Sự thay đổi khả năng kháng thuốc trong dòng Sib 1 (Elansky và cộng sự, 2001)
Địa điểm thu mẫu | Số lượng phân lập được phân tích | Số lượng chủng nhạy cảm (S), kháng yếu (SR) và kháng (R), số lượng (%) | ||
S | SR | R | ||
G. Vladivostok | 10 | 1 (10) | 4 (40) | 5 (50) |
G. Chita | 5 | 0 | 0 | 5 (100) |
Irkutsk | 9 | 9 (100) | 0 | 0 |
G. Krasnoyarsk | 13 | 12 (92) | 1 (8) | 0 |
Thành phố Yekaterinburg | 15 | 8 (53) | 1 (7) | 6 (40) |
O. Sakhalin | 66 | 0 | 0 | 66 (100) |
Vùng Omsk | 18 | 0 | 0 | 18 (100) |
Kháng Metalaxyl như một chất đánh dấu dân số
Vào đầu những năm 1980, bệnh mốc sương bùng phát mạnh mẽ do các chủng P. infestans kháng metalaxyl đã được ghi nhận ở nhiều vùng khác nhau. Các trang trại trồng khoai tây ở nhiều nước đã bị thiệt hại đáng kể (Dowley & O'Sullivan, 1981; Davidse và cộng sự, 1983; Derevyagina, 1991). Kể từ đó, ở nhiều quốc gia trên thế giới, việc giám sát liên tục sự xuất hiện của các chủng kháng phenylamide trong quần thể P. infestans đã được tiến hành. Ngoài việc đánh giá thực tế về triển vọng sử dụng các loại thuốc có chứa phenylamide, xây dựng một hệ thống các biện pháp bảo vệ và dự đoán biểu sinh, tính kháng với các loại thuốc này đã trở thành một trong những đặc điểm đánh dấu được sử dụng rộng rãi để phân tích so sánh các quần thể của mầm bệnh này. Tuy nhiên, việc sử dụng tính kháng metalaxyl trong các nghiên cứu quần thể so sánh cần được thực hiện có tính đến thực tế là: 1 - cơ sở di truyền của tính kháng vẫn chưa được xác định chính xác, 2 - tính kháng với metalaxyl là đặc điểm phụ thuộc chọn lọc có thể thay đổi tùy thuộc vào việc sử dụng phenylamit, 3 - khác nhau mức độ nhạy cảm với các chủng metalaxyl trong một dòng vô tính (bảng 1).
Quang phổ của isozyme
Các dấu hiệu isozyme thường không phụ thuộc vào các điều kiện bên ngoài, thể hiện sự di truyền Mendel và có tính đồng trội, cho phép phân biệt giữa thể đồng hợp và dị hợp tử. Việc sử dụng protein làm chất đánh dấu gen giúp xác định được cả các tổ chức lại lớn của vật liệu di truyền, bao gồm các đột biến nhiễm sắc thể và bộ gen, và các thay thế axit amin đơn lẻ.
Các nghiên cứu về điện di của protein đã chỉ ra rằng hầu hết các enzym tồn tại trong cơ thể sinh vật dưới dạng một số phân đoạn khác nhau về khả năng di chuyển điện di. Các phân đoạn này là kết quả của việc mã hóa nhiều dạng enzyme bởi các locus khác nhau (isozyme hoặc isozyme) hoặc bởi các allele khác nhau của cùng một locus (allozyme hoặc alloenzyme). Đó là, isozyme là các dạng khác nhau của một loại enzyme. Các dạng khác nhau có cùng hoạt tính xúc tác, nhưng hơi khác nhau về sự thay thế axit amin đơn lẻ trong peptit và phụ trách. Sự khác biệt như vậy được tiết lộ trong quá trình điện di.
Khi nghiên cứu các chủng P. infestans, phổ isoenzyme của hai protein, peptidase và glucose-6-phosphate isomerase, được sử dụng (enzyme này là đơn hình trong quần thể người Nga, do đó, các phương pháp nghiên cứu của nó không được trình bày trong công trình này). Để tách chúng thành các isozyme trong điện trường, các chế phẩm protein được phân lập từ các sinh vật được nghiên cứu được đưa vào một tấm gel đặt trong điện trường. Tốc độ khuếch tán của các protein riêng lẻ trong gel phụ thuộc vào điện tích và trọng lượng phân tử; do đó, trong điện trường, hỗn hợp các protein được phân tách thành các phần riêng lẻ, có thể được hình dung bằng cách sử dụng thuốc nhuộm đặc biệt.
Nghiên cứu về peptidase isoenzyme được thực hiện trên cellulose acetate, tinh bột hoặc gel polyacrylamide. Tiện lợi nhất là phương pháp dựa trên việc sử dụng gel xenlulo axetat do Helena Laboratories Inc. sản xuất. Nó không yêu cầu một lượng lớn vật liệu thử, nó cho phép người ta thu được các dải tương phản trên gel sau khi điện di cho cả hai locus enzyme, việc thực hiện nó không đòi hỏi thời gian và chi phí vật liệu lớn (Hình 2).
Một mảnh nhỏ của sợi nấm được chuyển vào một ống nhỏ 1,5 ml, thêm 1-2 giọt nước cất vào đó. Sau đó, mẫu được đồng nhất (ví dụ, bằng máy khoan điện có phụ kiện nhựa phù hợp với ống siêu nhỏ) và lắng trong 25 giây trên máy ly tâm ở tốc độ 13000 vòng / phút. 8 μl từ mỗi microtube. phần nổi phía trên được chuyển sang tấm bôi.
Gel xenlulo axetat được lấy ra khỏi hộp đệm, thấm vào giữa hai tờ giấy lọc và đặt lớp làm việc lên trên đế nhựa của dụng cụ bôi. Dung dịch từ đĩa được bôi lên gel 2-4 lần. Gel được chuyển sang buồng điện di,
Bảng 2. Thành phần của dung dịch dùng để nhuộm gel cellulose acetate trong phép phân tích peptidase isoenzyme, người ta nhỏ một giọt sơn (bromophenol blue) lên mép gel.
TRIS HCl, 0,05M, Ph 8,0 2 ml
Peroxidase, 1000 U / ml 5 giọt
o-dianisidine, 4 mg / ml 8 giọt
MgCl2, 20 mg / ml 2 giọt
Gly-Leu, 15 mg / ml 10 giọt
L-amino-acid oxidase, 20 u / ml 2 giọt
Quá trình điện di được thực hiện trong 20 phút. ở 200 V. Sau khi điện di, gel được chuyển sang bàn sơn và được sơn bằng dung dịch sơn đặc biệt (Bảng 2). 10 ml thạch DIFCO 1,6% được nấu chảy sơ bộ trong lò vi sóng, làm lạnh đến 60 ° C, sau đó 2 ml thạch được trộn với hỗn hợp sơn và đổ lên gel. Sọc xuất hiện trong vòng 15-20 phút. Thuốc thử L-amino-acid oxidase được thêm vào ngay trước khi trộn dung dịch với thạch nóng chảy.
Trong quần thể người Nga, locus Pep 1 được biểu thị bằng kiểu gen 100/100 và 92/100. Đồng hợp tử 92/92 là cực kỳ hiếm (khoảng 0,1%). Locus Rehr 2 được đại diện bởi ba kiểu gen 100/100, 100/112 và 112/112, và cả 3 biến thể đều khá phổ biến (Elanky và Smirnov, 2003, Hình 2).
Nghiên cứu bộ gen
Sự đa hình về chiều dài đoạn giới hạn với phép lai tiếp theo (RFLP-RG 57)
DNA tổng số được xử lý bằng enzyme giới hạn Eco R1, các đoạn DNA được phân tách bằng phương pháp điện di trong gel agarose. DNA hạt nhân rất lớn và có nhiều trình tự lặp đi lặp lại, điều này gây khó khăn cho việc phân tích trực tiếp vô số các đoạn thu được do tác động của các enzym giới hạn. Do đó, các đoạn DNA tách ra trong gel được chuyển đến một màng đặc biệt và được sử dụng để lai với mẫu dò RG 57, bao gồm các nucleotide được đánh dấu bằng nhãn phóng xạ hoặc huỳnh quang. Mẫu dò này lai với các trình tự gen lặp đi lặp lại (Goodwin và cộng sự, 1992, Forbes và cộng sự, 1998). Sau khi hình dung kết quả của phép lai trên vật liệu phóng xạ hoặc ánh sáng, ta thu được cấu hình lai đa locus (lấy dấu vân tay), được biểu thị bằng 25-29 đoạn (Forbes và cộng sự, 1998). Con cái vô tính (vô tính) sẽ có các cấu hình giống nhau. Bằng sự sắp xếp của các dải trên điện đồ, người ta có thể đánh giá sự giống và khác nhau của các sinh vật được so sánh.
Các kiểu đơn bội DNA ty thể
Trong hầu hết các tế bào nhân thực, mtDNA được trình bày dưới dạng một phân tử DNA vòng xoắn kép, không giống như nhiễm sắc thể nhân của tế bào nhân thực, sao chép bán bảo tồn và không liên kết với các phân tử protein.
Bộ gen ty thể của P. infestans đã được giải trình tự, và một số công trình được dành cho việc phân tích độ dài đoạn giới hạn (Carter và cộng sự, 1990, Goodwin, 1991, Gavino, Fry, 2002). Sau khi Griffith và Shaw (1998) phát triển một phương pháp đơn giản và nhanh chóng để xác định các haplotype mtDNA, dấu hiệu này đã trở thành một trong những phương pháp phổ biến nhất trong các nghiên cứu của P. Infestans. F2-R2 (Bảng 4) và sự hạn chế tiếp theo của chúng với các enzym giới hạn MspI (đoạn 4) và EcoR3 (đoạn 1). Phương pháp này cho phép bạn xác định 1 haplotype: Ia, IIa, Ib, IIb. Loại II khác với loại I bởi sự hiện diện của một hạt chèn có kích thước 2 bp và vị trí khác nhau của các vị trí hạn chế trong vùng P4 và P1881 (Hình 2).
Kể từ năm 1996, trong số các chủng được thu thập trên lãnh thổ Nga, chỉ có các chủng đơn bội Ia và IIa được ghi nhận (Elansky và cộng sự, 2001, 2015). Chúng có thể được xác định sau khi tách các sản phẩm giới hạn bằng mồi F2-R2 trong điện trường (Hình 4, 5). Các loại mtDNA được sử dụng trong phân tích so sánh các chủng và quần thể. Trong một số công trình, các loại DNA ty thể đã được sử dụng để phân lập các dòng vô tính và phân lập các chủng P. infestans (Botez và cộng sự, 2007; Shein và cộng sự, 2009). Sử dụng phương pháp PCR-RFLP, kết luận rằng mtDNA là không đồng nhất trong cùng một chủng P. infestans (Elansky và Milyutina, 2007). Điều kiện khuếch đại: 1x (500 giây. 94 ° C), 40x (30 giây. 90 ° C, 30 giây. 52 ° C, 90 giây. 72 ° C); 1x (5 phút 72 ° C). Hỗn hợp phản ứng: (20 μl): 0,2 U Taq DNA polymerase, 1x 2,5 mM đệm MgCl2-Taq, 0,2 mM mỗi dNTP, 30 pM mồi và 5 ng DNA được phân tích, nước khử ion - tối đa 20 μl.
Việc hạn chế sản phẩm PCR được thực hiện trong 4 - 6 giờ ở nhiệt độ 37 ° C. Hỗn hợp hạn chế (20 μl): 10x MspI (2 μl), đệm hạn chế 10x (2 μl), nước khử ion (6 μl), sản phẩm PCR (10 μl).
Bảng 3. Các mồi được sử dụng để khuếch đại các vùng đa hình mtDNA
Locus | Primer | Chiều dài và vị trí sơn lót | Chiều dài sản phẩm PCR | Hạn chế |
---|---|---|---|---|
P2 | F2: 5'- TTCCCTTTGTCCTCTACCGAT | Năm 21; 13619-13639 | 1070 | MspI |
R2: 5'- TTACGGCGGTTTAGCACATACA | Năm 22; 14688-14667 | |||
P4 | F4: 5'- TGGTCATCCAGAGGTTTATGTT | Năm 22; 9329-9350 | 964 | EcoRI |
R4:5 - CCGATACCGATACCAGCACCAA | Năm 22; 10292-10271 |
Khuếch đại mồi ngẫu nhiên (RAPD)
Khi thực hiện RAPD, một đoạn mồi được sử dụng (đôi khi nhiều đoạn mồi đồng thời) với trình tự nucleotide tùy ý, thường có chiều dài 10 nucleotide, với hàm lượng cao (từ 50%) nucleotide GC và nhiệt độ ủ thấp (khoảng 35 ° C). Những đoạn mồi như vậy “hạ cánh” trên nhiều vị trí bổ sung trong hệ gen. Sau khi khuếch đại, thu được một số lượng lớn amplicon. Số lượng của chúng phụ thuộc vào (các) mồi được sử dụng và điều kiện phản ứng (nồng độ MgCl2 và nhiệt độ ủ).
Việc hình dung amplicon được thực hiện bằng cách chưng cất trong gel polyacrylamide hoặc agarose. Khi thực hiện phân tích RAPD, cần theo dõi cẩn thận độ tinh khiết của vật liệu được phân tích, vì sự ô nhiễm với các vật thể sống khác có thể gây ra sự gia tăng đáng kể số lượng hiện vật, vốn có khá nhiều trong phân tích vật chất nguyên chất (Perez và cộng sự, 1998). Việc sử dụng phương pháp này trong nghiên cứu bộ gen của P. infestans được phản ánh trong nhiều công trình (Judelson, Roberts, 1999, Ghimire và cộng sự, 2002, Carlisle và cộng sự, 2001). Việc lựa chọn điều kiện phản ứng và mồi (51 mồi 10 nucleotide đã được nghiên cứu) được đưa ra trong bài báo của Abu-El Samen và cộng sự, (2003).
Phân tích lặp lại vi vệ tinh (SSR)
Các đoạn lặp lại của tế bào vi mô (lặp lại trình tự đơn giản, SSR) là các trình tự ngắn được lặp lại song song của 1-3 (đôi khi lên đến 6) nucleotide có trong bộ gen nhân của tất cả các sinh vật nhân chuẩn. Số lần lặp lại liên tiếp có thể thay đổi từ 10 đến 100. Các locus tế bào vi mô xảy ra với tần suất khá cao và ít nhiều phân bố đều khắp bộ gen (Lagercrantz và cộng sự, 1993). Tính đa hình của các trình tự tế bào vi mô có liên quan đến sự khác biệt về số lần lặp lại của mô típ cơ bản. Các dấu hiệu vi tế bào là chủ yếu, do đó có thể sử dụng chúng để phân tích cấu trúc dân số, xác định quan hệ họ hàng, con đường di cư kiểu gen, v.v. Trong số các ưu điểm khác của các chất đánh dấu này, cần lưu ý tính đa hình cao của chúng, khả năng tái tạo tốt, tính trung lập và khả năng thực hiện phân tích và đánh giá tự động. Ban đầu, phân tích được thực hiện với việc tách các sản phẩm phản ứng trên gel polyacrylamide. Sau đó, các nhân viên của Hệ thống sinh học ứng dụng đã đề xuất sử dụng mồi được đánh dấu huỳnh quang để phát hiện các sản phẩm phản ứng bằng cách sử dụng máy dò laze tự động (Diehl và cộng sự, 1990), và sau đó là trình tự động DNA tự động chuẩn (Ziegle và cộng sự, 1992). Việc ghi nhãn các mồi bằng các thuốc nhuộm huỳnh quang khác nhau giúp có thể phân tích nhiều điểm đánh dấu cùng một lúc trên một làn và do đó, làm tăng đáng kể năng suất của phương pháp và tăng độ chính xác của phép phân tích.
Các công bố đầu tiên dành cho việc sử dụng phân tích SSR để nghiên cứu P. infestans đã xuất hiện vào đầu những năm 2000. (Knapova, Gisi, 2002). Không phải tất cả các điểm đánh dấu do các tác giả đề xuất đều cho thấy mức độ đa hình đầy đủ, tuy nhiên, hai trong số chúng (4B và G11) được đưa vào bộ 12 dấu hiệu SSR do Lees và cộng sự (2006) đề xuất và sau đó được mạng lưới nghiên cứu Eucablight (www.eucablight .org) làm tiêu chuẩn cho P. infestans. Vài năm sau, một nghiên cứu đã được công bố về việc tạo ra một hệ thống phân tích ghép DNA của P. infestans dựa trên tám dấu hiệu SSR (Li và cộng sự, 2010). Cuối cùng, sau khi đánh giá tất cả các điểm đánh dấu được đề xuất trước đó và chọn ra cái có nhiều thông tin nhất trong số đó, cũng như tối ưu hóa mồi, nhãn huỳnh quang và điều kiện khuếch đại, cùng một nhóm tác giả đã trình bày một hệ thống phân tích ghép kênh một bước, bao gồm 12 điểm đánh dấu (Bảng 4; Li et al. , 2013a). Các mồi được sử dụng trong hệ thống này đã được chọn và dán nhãn bằng một trong bốn dấu huỳnh quang (FAM, VIC, NED, PET) để phạm vi kích thước alen của các mồi có cùng nhãn không trùng nhau.
Các tác giả đã thực hiện phân tích trên bộ khuếch đại PTC200 (MJ Research, Hoa Kỳ) bằng cách sử dụng bộ PCR đa kênh QIAGEN hoặc bộ PCR QIAGEN Typeit Microsatellite. Thể tích của hỗn hợp sau phản ứng là 12.5 μL. Các điều kiện khuếch đại như sau: đối với QIAGEN multiplex PCR: 95 ° C (15 phút), 30x (95 ° C (20 giây), 58 ° C (90 giây), 72 ° C (60 giây), 72 ° C (20 phút); đối với QIAGEN Type-it Microsatellite PCR: 95 ° C (5 phút), 28x (95 ° C (30 giây), 58 ° C (90 giây), 72 ° C (20 giây), 60 ° C (30 phút).
Việc tách và hình dung các sản phẩm PCR được thực hiện bằng máy phân tích DNA mao quản tự động ABI3730 (Hệ thống sinh học ứng dụng).
Bảng 4. Đặc điểm của 12 dấu hiệu SSR tiêu chuẩn được sử dụng để định dạng gen của P. Infestans (Li và cộng sự, 2013a)
tên | Số lượng alen | Phạm vi kích thước alen (bp) | Sơn lót |
Heo11 | 13 | 130-180 | F: NED-TGCTATTTATCAAGCGTGGG R: GTTTCATCTGCAGCCGTAAGA |
Pi02 | 4 | 255-275 | F: NED-ACTTGCAGAACTACCGCCC R: GTTTGACCACTTTCCTCGGTTC |
PinfSSR11 | 4 | 325-360 | F: NED-TTAAGCCACGACATGAGCTG R: GTTTAGACAAATTGTTTTGTGGTCGC |
D13 | 16 | 100-185 | FAM-TGCCCCCCCTGCTCACTC R: GCTCGAATTCATTTTACAGACTTG |
PinfSSR8 | 4 | 250-275 | FAM-AATCTGATCGCAACTGAGGG R: GTTTACAAGATACACACGTCGCTCC |
PinfSSR4 | 7 | 280-305 | FAM-TCTTGTTCGAGTATGGCGACG R: GTTTCACTTCGGGAGAAAGGCTTC |
Pi04 | 4 | 160-175 | F: VIC-AGCGGCTTTACCGATGG R: GTTTCAGCGGCTGTTTCGAC |
Pi70 | 3 | 185-205 | F: VIC-ATGAAAATACGTCAATGCTCG R: CGTTGGATATTTCTATTTCTTCG |
PinfSSR6 | 3 | 230-250 | F: GTTTTGGTGGGGCTGAAGTTTT R: VIC-TCGCCACAAGATTTATTCCG |
Pi63 | 3 | 265-280 | F: VIC-ATGACGAAGATGAAAGTGAGG R: CGTATTTTTCCTGTTTATCTAACACC |
PinfSSR2 | 3 | 165-180 | F: PET-CGACTTCTACATCAACCGGC R: GTTGCTTGGACTGCGTCTTTAGC |
Pi4B | 5 | 200-295 | F: PET-AAAATAAAGCCTTTGGTTCA R: GCAAGCGAGGTTTGTAGATT |
Một ví dụ về hình dung kết quả phân tích được thể hiện trong Hình. 6. Kết quả được phân tích bằng phần mềm GeneMapper 3.7 bằng cách so sánh dữ liệu thu được với dữ liệu của các chủng phân lập đã biết. Để thuận tiện cho việc giải thích các kết quả phân tích, cần phải đưa vào 1-2 mẫu phân lập tham chiếu với kiểu gen đã biết trong mỗi nghiên cứu.
Phương pháp nghiên cứu đề xuất đã được thử nghiệm trên một số lượng đáng kể các mẫu hiện trường, sau đó các tác giả đã tiến hành chuẩn hóa các giao thức giữa các phòng thí nghiệm của hai tổ chức, Viện James Hutton (Anh) và Đại học & Nghiên cứu Wageningen (Hà Lan), cùng với khả năng sử dụng thẻ FTA tiêu chuẩn để đơn giản hóa thu thập và vận chuyển các mẫu DNA của P. infestans, có thể nói về khả năng sử dụng thương mại của sự phát triển này. Ngoài ra, phương pháp phân lập kiểu gen P. infestans nhanh chóng và chính xác bằng cách sử dụng phân tích SSR đa hợp giúp thực hiện các nghiên cứu chuẩn hóa về quần thể mầm bệnh này trên quy mô toàn cầu và tạo ra cơ sở dữ liệu thế giới về bệnh mốc sương trong khuôn khổ dự án Eucablight (www.eucablight.org), bao gồm , bao gồm cả kết quả phân tích microatellite, giúp theo dõi sự xuất hiện và lan truyền của các kiểu gen mới trên khắp thế giới.
Đa hình độ dài đoạn giới hạn khuếch đại (AFLP). AFLP (đa hình độ dài đoạn khuếch đại) là công nghệ tạo ra các chỉ thị phân tử ngẫu nhiên bằng cách sử dụng các mồi cụ thể. Trong AFLP, DNA được xử lý bằng sự kết hợp của hai enzyme giới hạn. Các bộ điều hợp cụ thể được nối với các đầu dính của các mảnh hạn chế.
Sau đó, các đoạn này được khuếch đại bằng cách sử dụng các mồi bổ sung cho trình tự tiếp hợp và vị trí giới hạn, đồng thời mang thêm một hoặc nhiều bazơ ngẫu nhiên ở đầu 3 'của chúng. Tập hợp các đoạn thu được phụ thuộc vào các enzym giới hạn và các nucleotide được chọn ngẫu nhiên ở đầu 3'của mồi (Vos và cộng sự, 1995). AFLP - genotyping được sử dụng để nghiên cứu nhanh chóng sự biến đổi di truyền của các sinh vật khác nhau.
Mô tả chi tiết về phương pháp này được đưa ra trong các công trình của Mueller, Wolfenbarger, 1999, Savelkoul và cộng sự, 1999. Nhiều công trình so sánh độ phân giải của phương pháp AFLP và SSR đã được các nhà nghiên cứu Trung Quốc thực hiện. Các đặc điểm kiểu hình và kiểu gen của 48 chủng P. infestans được thu thập ở năm vùng của Hoa Bắc đã được nghiên cứu. Phổ AFLP cho thấy tám kiểu gen DNA khác nhau, trái ngược với kiểu gen SSR, không có sự đa dạng nào được tìm thấy (Guo và cộng sự, 2008).
Khuếch đại với các mồi tương đồng với trình tự của các phần tử di động
Các marker có nguồn gốc từ chuỗi retrotransposon rất thuận tiện cho việc lập bản đồ di truyền, nghiên cứu sự đa dạng di truyền và các quá trình tiến hóa (Schulman, 2006). Nếu các đoạn mồi được tạo ra để bổ sung cho trình tự ổn định của các phần tử di động nhất định, thì có thể khuếch đại các vùng gen nằm giữa chúng. Trong các nghiên cứu về tác nhân gây bệnh mốc sương, phương pháp khuếch đại vùng gen bằng cách sử dụng mồi bổ sung cho trình tự lõi của retroazone SINE (Các phần tử hạt nhân xen kẽ ngắn) đã được sử dụng thành công (Lavrova và Elansky, 2003). Sử dụng phương pháp này, sự khác biệt đã được tiết lộ ngay cả ở con cái vô tính của một dòng phân lập. Về vấn đề này, người ta kết luận rằng phương pháp inter - SINE - PCR có tính đặc hiệu cao và tỷ lệ di chuyển của các phần tử SINE trong hệ gen Phytophthora là cao.
Trong bộ gen của P. infestans, 12 họ retrotransposon ngắn (SINE) đã được xác định; Sự phân bố loài của các retrotransposon ngắn đã được nghiên cứu, các yếu tố (SINE) được xác định chỉ có trong bộ gen của P. infestans (Lavrova, 2004).
Đặc điểm của việc áp dụng phương pháp nghiên cứu so sánh các chủng trong nghiên cứu quần thể
Khi lập kế hoạch nghiên cứu, người ta phải hiểu rõ ràng các mục tiêu mà nó theo đuổi và sử dụng các phương pháp thích hợp. Do đó, một số phương pháp cho phép tạo ra một số lượng lớn các dấu hiệu đánh dấu độc lập, nhưng đồng thời chúng có độ tái lập thấp và phụ thuộc nhiều vào thuốc thử được sử dụng, điều kiện phản ứng và sự nhiễm bẩn của vật liệu đang nghiên cứu. Vì vậy, trong mỗi nghiên cứu một nhóm chủng, cần phải sử dụng một số chủng chuẩn (đối chứng), nhưng ngay cả trong trường hợp này, kết quả của một số thí nghiệm cũng rất khó kết hợp với nhau.
Nhóm phương pháp này bao gồm RAPD, AFLP, InterSSR, InterSINE PCR. Sau khi khuếch đại, thu được một số lượng lớn các đoạn DNA với các kích thước khác nhau. Nên sử dụng các kỹ thuật này nếu cần thiết để xác định sự khác biệt giữa các dòng có liên quan chặt chẽ (con bố mẹ, đột biến kiểu hoang dã, v.v.), hoặc trong trường hợp cần phân tích chi tiết một mẫu nhỏ. Do đó, phương pháp AFLP được sử dụng rộng rãi trong lập bản đồ di truyền của P. infestans (van der Lee và cộng sự, 1997) và trong các nghiên cứu cấy ghép (Knapova, Gisi, 2002, Cooke và cộng sự, 2003, Flier và cộng sự, 2003). Các phương pháp như vậy là không thực tế để sử dụng khi tạo cơ sở dữ liệu về các chủng, vì Thực tế là không thể thống nhất việc hạch toán các kết quả khi tiến hành phân tích trong các phòng thí nghiệm khác nhau.
Mặc dù có vẻ đơn giản và tốc độ thực hiện (phân lập DNA mà không cần tinh chế tốt, khuếch đại, hiển thị kết quả), nhóm phương pháp này yêu cầu sử dụng một phương pháp đặc biệt để ghi lại kết quả: chưng cất trong gel polyacrylamide với mồi được dán nhãn (phóng xạ hoặc phát quang) và tiếp xúc với ánh sáng hoặc chất phóng xạ. Hình ảnh gel agarose ethidium bromide thông thường thường không thích hợp cho các phương pháp này vì một số lượng lớn các đoạn DNA có kích thước khác nhau có thể hợp nhất với nhau.
Ngược lại, các phương pháp khác có thể tạo ra một số lượng nhỏ các đặc trưng với khả năng tái tạo rất cao của chúng. Nhóm này bao gồm nghiên cứu về các kiểu đơn bội DNA ty thể (chỉ có hai kiểu đơn bội Ia và IIa được ghi nhận ở Nga), kiểu giao phối (hầu hết các chủng phân lập được chia nhỏ thành 2 loại: A1 và A2, hiếm khi tìm thấy SF tự sinh) và phổ isozyme peptidase (hai locus Pep1 và Pep2 , bao gồm hai isozyme, mỗi isozyme) và glucose-6-phosphate isomerase (ở Nga không có sự thay đổi trong đặc điểm này, mặc dù tính đa hình đáng kể được ghi nhận ở các nước khác trên thế giới). Nên sử dụng các tính năng này khi phân tích bộ sưu tập, biên dịch cơ sở dữ liệu khu vực và toàn cầu. Trong trường hợp phân tích isozyme và haplotype của DNA ti thể, có thể thực hiện mà không cần đến các chủng tiêu chuẩn, trong khi phân tích các kiểu giao phối, cần phải có hai dòng phân lập thử nghiệm với các kiểu giao phối đã biết.
Các điều kiện phản ứng và thuốc thử chỉ có thể ảnh hưởng đến độ tương phản của sản phẩm trên biểu đồ điện tâm đồ; việc biểu hiện hiện vật trong các loại nghiên cứu này khó xảy ra.
Hiện tại, hầu hết các quần thể ở phần châu Âu của Nga được biểu hiện bằng các chủng của cả hai kiểu giao phối (Bảng 6), trong số đó có các chủng phân lập với kiểu Ia và IIa của DNA ty thể (các loại mtDNA khác trên thế giới không được tìm thấy ở Nga sau năm 1993). Phổ của các isozyme peptidase được biểu thị bởi hai kiểu gen tại locus Pep1 (100/100, 92/92 và dị hợp tử 92/100, và kiểu gen 92/92 là cực kỳ hiếm (<0,3%)) và hai kiểu gen tại locus Pep 2 (100/100 , 112/112 và dị hợp tử 100/112, với kiểu gen 112/112 xảy ra ít thường xuyên hơn 100/100, nhưng cũng khá thường xuyên).
Không có sự thay đổi trong phổ isoenzyme của glucose-6-phosphate isomerase sau năm 1993 (sự biến mất của dòng vô tính US-1); tất cả các dòng phân lập được nghiên cứu đều có kiểu gen 100/100 (Elansky và Smirnov, 2002).
Nhóm phương pháp thứ ba giúp có được một nhóm đủ các ký tự đánh dấu độc lập với khả năng tái tạo cao. Ngày nay, nhóm này bao gồm đầu dò RFLP-RG57, tạo ra 25-29 đoạn DNA có kích thước khác nhau. RFLP-RG57 có thể được sử dụng cả khi phân tích mẫu và biên dịch cơ sở dữ liệu. Tuy nhiên, phương pháp này đắt hơn nhiều so với những phương pháp trước, tốn nhiều thời gian và cần một lượng đủ lớn DNA tinh khiết cao. Do đó, nhà nghiên cứu buộc phải giới hạn khối lượng của vật liệu được thử nghiệm.
Sự phát triển của RFLP-RG57 vào đầu những năm 90 của thế kỷ trước đã tăng cường đáng kể các nghiên cứu quần thể về tác nhân gây bệnh mốc sương. Nó trở thành cơ sở của phương pháp dựa trên việc lựa chọn và phân tích "Dòng vô tính" (xem bên dưới). Cùng với RFLP-RG57, kiểu giao phối, dấu vân tay DNA (phương pháp RFLP-RG57), phổ của peptidase và isoenzyme glucose-6-phosphate isomerase, và kiểu DNA ty thể được sử dụng để xác định các dòng vô tính. Nhờ ông, nó đã được chỉ ra cho các cộng sự, 1994), sự thay thế các quần thể cũ bằng các quần thể mới (Drenth và cộng sự, 1993, Sujkowski và cộng sự, 1994, Goodwin và cộng sự, 1995a), đã cho thấy các dòng vô tính phổ biến ở nhiều nước trên thế giới. Các nghiên cứu về các chủng Nga sử dụng phương pháp này cho thấy sự đa hình về kiểu gen cao của các chủng ở phần Châu Âu và tính đơn hình của các quần thể ở khu vực Châu Á và Viễn Đông của Nga (Elansky và cộng sự, 2001). Và hiện nay phương pháp này vẫn là phương pháp chính trong các nghiên cứu dân số của P. infestans. Tuy nhiên, sự phân bố rộng rãi của nó bị cản trở bởi chi phí khá cao và cường độ lao động trong quá trình thực hiện.
Một kỹ thuật đầy hứa hẹn khác hiếm khi được sử dụng trong các nghiên cứu P. infestans là phân tích lặp lại microatellite (SSR). Hiện nay, phương pháp này được sử dụng rộng rãi để phân lập dòng vô tính. Để phân tích các chủng, các đặc điểm đánh dấu kiểu hình như sự hiện diện của gen độc lực đối với các giống khoai tây (Avdey, 1995, Ivanyuk và cộng sự, 2002, Ulanova và cộng sự, 2003) và cà chua đã được sử dụng rộng rãi (và tiếp tục được sử dụng). Hiện nay, các gen độc lực của các giống khoai tây đã không còn giá trị như các đặc điểm đánh dấu cho các nghiên cứu quần thể do sự xuất hiện của số lượng tối đa (hoặc gần bằng) các gen độc lực trong phần lớn các dòng phân lập. Đồng thời, gen độc lực T1 đối với cây cà chua mang gen Ph1 tương ứng vẫn được sử dụng thành công như một tính trạng đánh dấu (Lavrova và cộng sự, 2003; Ulanova và cộng sự, 2003).
Trong nhiều công trình, khả năng kháng thuốc diệt nấm được sử dụng như một đặc điểm đánh dấu. Đặc điểm này không được khuyến khích sử dụng trong các nghiên cứu quần thể do sự xuất hiện khá dễ dàng của các đột biến kháng thuốc ở các dòng vô tính sau khi sử dụng metalaxyl- (hoặc mefenoxam-) có chứa thuốc diệt nấm trên đồng ruộng. Ví dụ, sự khác biệt đáng kể về mức độ đề kháng được thể hiện trong dòng vô tính Sib1 (Elansky và cộng sự, 2001).
Do đó, kiểu giao phối, phổ peptidase isoenzyme, kiểu DNA ty thể, RFLP-RG57, SSR là những đặc điểm đánh dấu được ưu tiên để tạo ngân hàng dữ liệu và ghi nhãn chủng trong bộ sưu tập. Để so sánh các mẫu giới hạn, nếu cần áp dụng số lượng đặc điểm đánh dấu tối đa, bạn có thể sử dụng AFLP, RAPD, InterSSR, Inter-SINE PCR (Bảng 5). Tuy nhiên, cần nhớ rằng các phương pháp này có khả năng tái lập kém, và trong mỗi thí nghiệm riêng lẻ (chu trình điện di khuếch đại), cần phải sử dụng một số mẫu phân lập tham chiếu.
Bảng 5. So sánh các phương pháp nghiên cứu các chủng khác nhau P. infestans
Tiêu chuẩn | TC | Cảnh sát Isofer | mtDNA | RFLP-RG57 | RAPD | ISSR | SSR | AFLP | Rev |
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Lượng thông tin | Н | Н | Н | С | В | В | С | В | В |
Khả năng tái lập | В | В | В | В | Н | Н | С | С | С |
Khả năng tạo tác | Н | Н | Н | Н | В | С | Н | С | В |
chi phí | Н | С | Н | В | Н | Н | Н | С | Н |
Cường độ lao động | Н | Н | Н | В | NS * | NS * | Н | С | NS * |
Tốc độ phân tích ** | В | Н | Н | С | Н | Н | Н | Н | Н |
Lưu ý: H - thấp, C - trung bình, B - cao; НС * - cường độ lao động thấp khi sử dụng gel agarose hoặc tự động
máy tạo kiểu gen, môi trường - bằng cách chưng cất trong gel polyacrylamide với các mồi được dán nhãn,
** - không tính thời gian phát triển sợi nấm để phân lập DNA.
Cơ cấu dân số
Dòng vô tính
Trong trường hợp không có tái tổ hợp hoặc đóng góp không đáng kể vào cấu trúc quần thể, quần thể bao gồm một số dòng vô tính nhất định, sự trao đổi gen giữa các dòng này là cực kỳ hiếm.
Trong những quần thể như vậy, sẽ có nhiều thông tin hơn nếu không nghiên cứu tần số của các gen riêng lẻ, mà là tần số của các kiểu gen có nguồn gốc chung (dòng vô tính hoặc dòng vô tính) và chỉ khác nhau về đột biến điểm. Các nghiên cứu quần thể về mầm bệnh mốc sương và phân tích các dòng vô tính đã tăng tốc đáng kể kể từ khi phương pháp RFLP-RG57 ra đời vào đầu những năm 90 của thế kỷ trước. Cùng với RFLP-RG57, kiểu giao phối, phổ của peptidase và glucose-6-phosphate isomerase isoenzyme, và kiểu DNA ty thể được sử dụng để xác định các dòng vô tính. Đặc điểm của các dòng vô tính phổ biến nhất được trình bày trong Bảng 6.
Bản sao US-1 thống trị quần thể ở khắp mọi nơi cho đến cuối những năm 80, sau đó nó bắt đầu bị thay thế bởi các bản sao khác và biến mất khỏi châu Âu và Bắc Mỹ. Hiện nay nó được tìm thấy ở Viễn Đông (Philippines, Đài Loan, Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, Koh và cộng sự, 1994, Mosa và cộng sự, 1993), ở Châu Phi (Uganda, Kenya, Rwanda, Goodwin và cộng sự, 1994, Vega-Sanchez và cộng sự cộng sự, 2000; Ochwo và cộng sự, 2002) và ở Nam Mỹ (Ecuador, Brazil, Peru, Forbes và cộng sự, 1997, Goodwin và cộng sự, 1994). Không có chủng nào thuộc dòng US-1 đã được xác định chỉ riêng ở Úc. Rõ ràng, các chủng P. infestans đã đến Úc với một làn sóng di cư khác (Goodwin, 1997).
Nhân bản US-6 di cư từ miền bắc Mexico đến California vào cuối những năm 70 và gây ra dịch bệnh trên khoai tây và cà chua sau 32 năm sạch bệnh. Do tính hung hăng cao, nó đã thay thế dòng sao US-1 và bắt đầu thống trị vùng bờ biển phía tây của Hoa Kỳ (Goodwin et al., 1995a).
Các kiểu gen US-7 và US-8 được phát hiện ở Hoa Kỳ vào năm 1992 và đến năm 1994 đã được phân phối rộng rãi ở Hoa Kỳ và Canada. Trong một vụ ruộng, dòng US-8 có thể thay thế gần như hoàn toàn dòng US-1 trong các lô khoai tây ban đầu bị nhiễm cả hai dòng ở nồng độ ngang nhau (Miller và Johnson, 2000).
Các dòng vô tính BC-1 đến BC-4 đã được xác định ở British Columbia trong một số lượng nhỏ các dòng phân lập từ Goodwin và cộng sự, 1995b). Bản sao US-11 lan rộng ở Hoa Kỳ và thay thế US-1 ở Đài Loan. Các bản sao JP-1 và EC-1, cùng với bản sao US-1, lần lượt phổ biến ở Nhật Bản và Ecuador (Koh et al., 1994; Forbes et al., 1997).
SIB-1 là một bản sao phổ biến ở Nga trên một vùng lãnh thổ rộng lớn từ vùng Moscow đến Sakhalin. Ở khu vực Moscow, nó được phát hiện vào năm 1993, và một số quần thể thực địa chủ yếu bao gồm các chủng của dòng vô tính này, có khả năng kháng metalaxyl cao. Sau năm 1993, sự phổ biến của dòng vô tính này giảm đáng kể. Bên ngoài Urals vào năm 1997-1998, SIB-1 được tìm thấy ở khắp mọi nơi, ngoại trừ Lãnh thổ Khabarovsk (SIB-2 nhân bản phổ biến ở đó). Sự tách biệt về không gian của các dòng vô tính với các kiểu giao phối khác nhau đã loại trừ quá trình hữu tính ở Siberia và Viễn Đông. Ở khu vực Moscow, trái ngược với Siberia, dân số được đại diện bởi nhiều dòng vô tính; hầu hết mọi dòng phân lập đều có một kiểu gen đa lá độc nhất (Elansky và cộng sự, 2001, 2015). Sự đa dạng này không thể được giải thích chỉ bởi việc nhập khẩu các chủng nấm từ các vùng khác nhau trên thế giới với nguyên liệu giống nhập khẩu. Vì cả hai kiểu giao phối đều xảy ra trong quần thể, nên có thể sự đa dạng của nó cũng là do sự tái tổ hợp. Do đó, ở British Columbia, sự xuất hiện của các kiểu gen BC-2, BC-3 và BC-4 được giả định là do lai giữa các dòng vô tính BC-1 và US-6 (Goodwin et al., 1995b). Có thể là các chủng lai được tìm thấy trong quần thể ở Moscow. Ví dụ, các chủng MO-4, MO-8 và MO-11 dị hợp tử đối với locus PEP có thể là con lai giữa các chủng MO-12, MO-21, MO-22, có kiểu bắt cặp A2 và đồng hợp tử về một alen của locus PEP và chủng MO-8, có kiểu giao phối A1 và đồng hợp tử về một alen khác của locus. Và nếu đúng như vậy, và trong các quần thể P. infestans hiện đại, có xu hướng gia tăng vai trò của quá trình sinh dục, thì giá trị thông tin của việc phân tích các dòng vô tính nhiều lá sẽ giảm (Elansky và cộng sự, 2001, 2015).
Sự biến đổi trong các dòng vô tính
Cho đến những năm 90 của thế kỷ 20, dòng vô tính US-1 đã phổ biến rộng rãi trên thế giới. Hầu hết các quần thể đồng ruộng và khu vực chỉ bao gồm các chủng có kiểu gen US-1. Tuy nhiên, sự khác biệt giữa các dòng phân lập cũng được quan sát thấy, rất có thể do một quá trình đột biến gây ra. Đột biến xảy ra ở cả DNA hạt nhân và ty thể và ảnh hưởng đến mức độ kháng thuốc phenylamide và số lượng gen độc lực. Các dòng khác với kiểu gen ban đầu do đột biến được biểu thị bằng số bổ sung sau dấu chấm theo sau tên của kiểu gen ban đầu (ví dụ: dòng đột biến US-1.1 của dòng vô tính US-1). Dòng DNA vân tay US-1.5 và US-1.6 chứa các dòng phụ có kích thước khác nhau (Goodwin et al., 1995a, 1995b); dòng vô tính US-6.3 cũng khác với dòng phụ kiện US-6 trong một (Goodwin, 1997, Bảng 7).
Trong nghiên cứu về DNA của ty thể, người ta thấy rằng trong dòng vô tính US-1 chỉ tìm thấy loại 1b của DNA ty thể (Carter và cộng sự, 1990). Tuy nhiên, trong nghiên cứu về các chủng dòng vô tính này từ Peru và Philippines, người ta đã tìm thấy các chủng phân lập có kiểu DNA ty thể khác với 1b khi có sự chèn và mất đoạn (Goodwin, 1991, Koh và cộng sự, 1994).
Bảng 6. Kiểu gen đa bội của một số dòng vô tính P. infestans
tên | Loại giao phối | Isozyme | Dấu vân tay DNA | Loại MtDNA | |
GPI | PEP | ||||
US-1 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1.0111010110011E + 24 | Ib |
US-2 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1.0111010010011E + 24 | - |
US-3 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1.0111000000011E + 24 | - |
US-4 | A1 | 100/100 | 92/92 | 1.0111010010011E + 24 | - |
US-5 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0111010010011E + 24 | - |
US-6 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0111110010011E + 24 | IIb |
US-7 | A2 | 100/111 | 100/100 | 1.0011000010011E + 24 | Ia |
US-8 | A2 | 100/111/122 | 100/100 | 1.0011000010011E + 24 | Ia |
US-9 | A1 | 100/100 | 83/100 | * | - |
US-10 | A2 | 111/122 | 100/100 | - | - |
US-11 | A1 | 100/111 | 92/100 | 1.0101110010011E + 24 | IIb |
US-12 | A1 | 100/111 | 92/100 | 1.0001000010011E + 24 | - |
US-14 | A2 | 100/122 | 100/100 | 1.0000000000011E + 24 | - |
US-15 | A2 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000010011E + 24 | Ia |
US-16 | A1 | 100/111 | 100/100 | 1.0001100010011E + 24 | - |
US-17 | A1 | 100/122 | 100/100 | 1.0100010000011E + 24 | - |
US-18 | A2 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000010011E + 24 | Ia |
US-19 | A2 | 100/100 | 92/100 | 1.0101010000011E + 24 | Ia |
EC-1 | A1 | 90/100 | 96/100 | 1.1111010010011E + 24 | IIa |
SIB-1 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000110011E + 24 | IIa |
SIB-2 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000010011E + 24 | IIa |
SIB-3 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.1001010100011E + 24 | IIa |
MO-1 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000110011E + 24 | IIa |
MO-2 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000010011E + 24 | Ia |
MO-3 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101000010011E + 24 | IIa |
MO-4 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0101110110011E + 24 | IIa |
MO-5 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0001010010011E + 24 | IIa |
MO-6 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010010011E + 24 | Ia |
MO-7 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000110011E + 24 | IIa |
MO-8 | A1 | 100/100 | 92/92 | 1.0101100010011E + 24 | IIa |
MO-9 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000010011E + 24 | IIa |
MO-10 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101100000011E + 24 | Ia |
MO-11 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0101010010011E + 24 | Ia |
MO-12 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010010011E + 24 | Ia |
MO-13 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011E + 24 | Ia |
MO-14 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.01010010011E + 22 | Ia |
MO-15 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.101110010011E + 23 | Ia |
MO-16 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000000011E + 24 | IIa |
MO-17 | A1 | 86/100 | 100/100 | 1.0101010110011E + 24 | Ib |
MO-18 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101110010011E + 24 | IIa |
MO-19 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011E + 24 | IIa |
MO-20 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011E + 24 | IIa |
MO-21 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011E + 24 | IIa |
Lưu ý: * - không có dữ liệu.
Bảng 7. Các kiểu gen đa bội và các dòng đột biến của chúng
tên | Loại giao phối | | Dấu vân tay DNA (RG57) | Ghi chú | |
GPI | PEP-1 | ||||
US-1 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101011001101000110011 | Kiểu gen ban đầu 1 |
US-1.1 | A1 | 86/100 | 100/100 | 1011101011001101000110011 | Đột biến trong PEP |
US-1.2 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101010001101000110011 | Đột biến trong RG57 |
US-1.3 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101001001101000110011 | Đột biến trong RG57 |
US-1.4 | A1 | 86/100 | 100/100 | 1011101010001101000110011 | Đột biến trong RG57 và PEP |
US-1.5 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101011001101010110011 | Đột biến trong RG57 |
US-6 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011111001001100010110011 | Kiểu gen ban đầu 2 |
US-6.1 | A1 | 100/100 | 92 /92 | 1011111001001100010110011 | Đột biến trong PEP |
US-6.2 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011101001001100010110011 | Đột biến trong RG57 |
US-6.3 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011111001011100010110011 | Đột biến trong RG57 |
US-6.4 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1011011001001100010110011 | Đột biến trong RG57 và PEP |
US-6.5 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011111001001100010010011 | Đột biến trong RG57 |
BR-1 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1011101000001100001111011 | Kiểu gen ban đầu 3 |
BR-1.1 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1010101000001100001110011 | Đột biến trong RG57 |
Ngoài ra còn có những thay đổi trong phổ của isozyme. Theo nguyên tắc, chúng được gây ra bởi sự phân hủy một sinh vật ban đầu dị hợp tử với enzym này thành những sinh vật đồng hợp tử. Năm 1993, trên quả cà chua, chúng tôi đã xác định được một dòng có các đặc điểm điển hình cho dấu vân tay US-1: RG57, kiểu DNA ty thể và kiểu gen 86/100 cho glucose-6-phosphatizomerase, nhưng nó là đồng hợp tử (100/100) cho locus peptidase đầu tiên thay vì 92/100 dị hợp tử điển hình của dòng vô tính này. Chúng tôi đặt tên cho kiểu gen của dòng này là MO-17 (Bảng 6). Các dòng đột biến US-1.1 và US-1.4 cũng khác với US-1 bởi các đột biến ở locus peptidase đầu tiên (Bảng 7).
Đột biến dẫn đến thay đổi số lượng gen độc lực đối với các giống khoai tây và cà chua là khá phổ biến. Chúng được ghi nhận trong số các phân lập của dòng vô tính US-1 trong các quần thể từ Hà Lan (Drenth và cộng sự, 1994), Peru (Goodwin và cộng sự, 1995a), Ba Lan (Sujkowski và cộng sự, 1991), bắc Bắc Mỹ (Goodwin và cộng sự, ., 1995b). Sự khác biệt về số lượng gen độc lực của khoai tây cũng được ghi nhận giữa các dòng phân lập của dòng vô tính US-7 và US-8 ở Canada và Hoa Kỳ (Goodwin và cộng sự, 1995a), giữa các dòng phân lập của dòng SIB-1 ở phần châu Á của Nga (Elansky và cộng sự, 2001 ).
Các phân lập có sự khác biệt mạnh về mức độ kháng thuốc phenylamide được xác định trong quần thể trường đơn dòng, tất cả đều thuộc dòng vô tính Sib-1 (Elansky và cộng sự, 2001, Bảng 1). Hầu hết tất cả các chủng của dòng vô tính US-1 đều rất nhạy cảm với metalaxyl; tuy nhiên, các chủng kháng cao của dòng này được phân lập ở Philippines (Koh và cộng sự, 1994) và ở Ireland (Goodwin và cộng sự, 1996).
Quần thể P. infestans hiện đại
Trung Mỹ (Mexico)
Quần thể P. infestans ở Mexico khác biệt rõ rệt với các quần thể khác trên thế giới, điều này chủ yếu là do vị trí lịch sử của nó. Nhiều nghiên cứu về quần thể này và các loài P. infestans liên quan của chi Phytophthora, cũng như các loài địa phương của chi Solanum, đã dẫn đến kết luận rằng sự tiến hóa của mầm bệnh ở miền trung Mexico xảy ra cùng với sự tiến hóa của cây ký chủ và có liên quan đến sự tái tổ hợp hữu tính (Grünwald, Flier , 2005). Cả hai kiểu giao phối đều được đại diện trong quần thể, với tỷ lệ ngang nhau, và sự hiện diện của bào tử trứng trong đất, trên cây và củ khoai tây và các loài có họ hàng mọc hoang Solanum xác nhận sự hiện diện của quá trình hữu tính trong quần thể (Fernández-Pavía et al., 2002). Các nghiên cứu gần đây về Thung lũng Toluca và các vùng xung quanh của nó (trung tâm giả định nguồn gốc của mầm bệnh) đã xác nhận tính đa dạng di truyền cao của quần thể địa phương của P. infestans (134 kiểu gen đa lá trong một mẫu 176 mẫu) và sự hiện diện của một số quần thể con khác biệt trong khu vực (Wang và cộng sự, 2017). Các yếu tố góp phần vào sự khác biệt này là sự phân chia theo không gian của các quần thể phụ đặc trưng của vùng cao nguyên miền trung Mexico, sự khác biệt về điều kiện canh tác và các giống khoai tây được sử dụng ở các thung lũng và núi, và sự hiện diện của các loài Solanum có củ hoang dã có thể hoạt động như vật chủ thay thế (Fry et al ., 2009).
Tuy nhiên, cần lưu ý rằng quần thể P. infestans ở miền bắc Mexico khá vô tính và giống với quần thể Bắc Mỹ hơn, điều này có thể chỉ ra rằng đây là những kiểu gen mới (Fry và cộng sự, 2009).
Северная Америка
Các quần thể P. infestans ở Bắc Mỹ luôn có cấu trúc rất đơn giản và đặc tính vô tính của chúng đã được hình thành từ rất lâu trước khi sử dụng phân tích microsatellite. Cho đến năm 1987, dòng vô tính US-1 thống trị ở Hoa Kỳ và Canada (Goodwin et al., 1995). Vào giữa những năm 70, khi các loại thuốc diệt nấm dựa trên metalaxyl xuất hiện, dòng vô tính này bắt đầu được thay thế bằng các kiểu gen khác, kháng hơn di cư từ Mexico (Goodwin và cộng sự, 1998). Đến cuối những năm 90. kiểu gen US-8 thay thế hoàn toàn kiểu gen US-1 ở Hoa Kỳ và trở thành dòng vô tính trội trên khoai tây (Fry et al., 2009; Fry et al., 2015). Tình hình khác với cà chua, cà chua liên tục chứa một số dòng vô tính, và thành phần của chúng thay đổi theo từng năm (Fry và cộng sự, 2009).
Năm 2009, một dịch bệnh mốc sương quy mô lớn đã bùng phát tại Hoa Kỳ trên cà chua. Một đặc điểm của đại dịch này là nó bùng phát gần như đồng thời ở nhiều nơi ở đông bắc Hoa Kỳ, và hóa ra nó có liên quan đến việc bán ồ ạt cây giống cà chua bị nhiễm bệnh tại các trung tâm vườn lớn (Fry et al., 2013). Những thiệt hại về mùa màng là rất lớn. Phân tích microsatellite của các mẫu bị ảnh hưởng cho thấy chủng đại dịch thuộc về kiểu giao phối dòng vô tính US-22 A2. Năm 2009, tỷ lệ kiểu gen này trong quần thể P. infestans ở Mỹ đạt 80% (Fry và cộng sự, 2013). Trong những năm tiếp theo, tỷ lệ kiểu gen tích cực US-23 (chủ yếu trên cà chua) và US-24 (trên khoai tây) tăng đều trong quần thể, tuy nhiên, sau năm 2011, tỷ lệ phát hiện US-24 giảm đáng kể và cho đến nay, khoảng 90% quần thể mầm bệnh ở Hoa Kỳ được đại diện bởi kiểu gen US-23 (Fry và cộng sự, 2015).
Ở Canada, cũng như ở Hoa Kỳ, vào cuối những năm 90. kiểu gen trội US-1 được thay thế bởi US-8, vị trí ưu thế không thay đổi cho đến năm 2008. Trong năm 2009-2010. Ở Canada, đã có dịch bệnh mốc sương nghiêm trọng liên quan đến việc bán cây giống cà chua bị nhiễm bệnh, nhưng chúng do các kiểu gen US-23 và US-8 gây ra (Kalischuk et al., 2012). Sự khác biệt rõ ràng về mặt địa lý của những kiểu gen này rất đáng chú ý: US-23 thống trị các tỉnh phía tây Canada (68%), trong khi US-8 thống trị các tỉnh phía đông (83%). Trong những năm tiếp theo, US-23 lan rộng đến các khu vực phía đông; tuy nhiên, nhìn chung, tỷ lệ của nó trong dân số giảm nhẹ so với sự xuất hiện của các kiểu gen US-22 và US-24 trong nước (Peters et al., 2014). Đến nay, US-23 duy trì vị trí thống trị trên toàn Canada; US-8 có mặt ở British Columbia, trong khi US-23 và US-24 có mặt ở Ontario (Peters, 2017).
Do đó, các quần thể P. infestans ở Bắc Mỹ chủ yếu là các dòng vô tính. Trong vòng 40 năm qua, số kiểu gen vô tính được phát hiện đã lên tới 24. Mặc dù thực tế là các chủng của cả hai kiểu giao phối đều có mặt trong quần thể, nhưng xác suất xuất hiện các kiểu gen mới do tái tổ hợp hữu tính vẫn khá thấp. Tuy nhiên, trong 20 năm qua, một số trường hợp xuất hiện quần thể tái tổ hợp phù du đã được ghi nhận (Gavino và cộng sự, 2000; Danies và cộng sự, 2014; Peters và cộng sự, 2014), và trong một trường hợp, kết quả của phép lai là kiểu gen US-11 , đã cố thủ ở Bắc Mỹ trong nhiều năm (Gavino và cộng sự, 2000). Cho đến năm 2009, những thay đổi trong cấu trúc của quần thể có liên quan đến sự xuất hiện của những kiểu gen mới, hung hãn hơn với sự di cư tiếp theo của chúng và sự dịch chuyển của những loài tiền nhiệm thống trị trước đó. Điều gì đã xảy ra trong năm 2009-2010 Tại Hoa Kỳ và Canada, nghiên cứu biểu sinh lần đầu tiên cho thấy rằng trong thời đại toàn cầu hóa, sự bùng phát của bệnh có thể liên quan đến sự lây lan tích cực của các kiểu gen mới khi bán vật liệu trồng bị nhiễm bệnh.
nam Mỹ
Cho đến gần đây, các nghiên cứu về quần thể P. infestans ở Nam Mỹ không thường xuyên và quy mô lớn. Được biết, cấu trúc của các quần thể này khá đơn giản và bao gồm 1-5 dòng dõi vô tính trên mỗi quốc gia (Forbes et al., 1998). Vì vậy, đến năm 1998, các kiểu gen US-1 (Brazil, Chile) BR-1 (Brazil, Bolivia, Uruguay, Paraguay), EC-1 (Ecuador, Colombia, Peru và Venezuela), AR-1, AR -2, AR-3, AR-4 và AR-5 (Argentina), PE-3 và PE-7 (miền nam Peru). Kiểu giao phối A2 có mặt ở Brazil, Bolivia và Argentina và không được tìm thấy bên ngoài biên giới Bolivia-Peru trong khu vực Hồ Titicaca, phía sau kiểu gen EC-1 A1 chiếm ưu thế ở dãy Andes. Trên cà chua, US-1 vẫn là kiểu gen trội trên khắp Nam Mỹ.
Tình hình ít nhiều vẫn tiếp diễn trong những năm 2000. Một điểm quan trọng là việc phát hiện ra một dòng vô tính mới EC-2 thuộc loại A2 trên họ hàng hoang dã của khoai tây (S. brevifolium và S. tetrapetalum) ở Bắc Andes (Oliva và cộng sự, 2010). Các nghiên cứu về phát sinh loài đã chỉ ra rằng dòng này không hoàn toàn giống với P. infestans, mặc dù nó có liên quan chặt chẽ với nó, về mối liên hệ này, người ta đã đề xuất xem xét nó, cũng như một dòng khác, EC-3, được phân lập từ cây cà chua S. betaceum mọc ở Andes, một loài mới được gọi là P. andina; tuy nhiên, tình trạng của loài này (một loài độc lập hoặc lai giữa P. infestans với một số dòng vẫn chưa được biết đến) vẫn chưa rõ ràng (Delgado và cộng sự, 2013).
Hiện tại, tất cả các quần thể P. infestans ở Nam Mỹ là vô tính. Bất chấp sự hiện diện của cả hai kiểu giao phối, không có quần thể tái tổ hợp nào được xác định. Trên cà chua, kiểu gen US-1 phổ biến khắp nơi, dường như được thay thế từ khoai tây bởi các chủng địa phương, nguồn gốc chính xác của chúng vẫn chưa được biết. Ở Brazil, Bolivia và Uruguay, kiểu gen BR-1 có mặt; ở Peru, cùng với US-1 và EC-1, có một số kiểu gen địa phương khác. Trong dãy Andes, vị trí thống trị được giữ lại bởi dòng vô tính EC-1, mối quan hệ của dòng này với P. andina được phát hiện gần đây vẫn chưa được khám phá. Nơi duy nhất "không ổn định" trong giai đoạn 2003-2013. đã có những thay đổi đáng kể trong dân số, trở thành Chile (Acuña et al., 2012), nơi vào năm 2004-2005. quần thể mầm bệnh trở nên đặc trưng bởi khả năng kháng metalaxyl và một loại đơn bội DNA ti thể mới (Ia thay vì Ib trước đây). 2006 đến 2011 trong quần thể, kiểu gen 21 (theo SSR) chiếm ưu thế, tỷ lệ trong số đó đạt 90%, sau đó cọ chuyển sang kiểu gen 20, tần suất xuất hiện trong hai năm tiếp theo được giữ ở mức khoảng 67% (Acuña, 2015).
Âu châu
Trong lịch sử châu Âu, đã có ít nhất hai làn sóng di cư của P. infestans từ Bắc Mỹ: vào thế kỷ 1. (HERB-1) và đầu thế kỷ 70 (US-1). Sự phân bố phổ biến của thuốc diệt nấm có chứa metalaxyl vào những năm XNUMX. dẫn đến sự thay thế kiểu gen trội US-XNUMX và thay thế nó bằng kiểu gen mới. Kết quả là, ở hầu hết các nước Tây Âu, quần thể mầm bệnh chủ yếu được biểu thị bằng một số dòng vô tính.
Việc sử dụng phân tích microsatellite để phân tích các quần thể mầm bệnh giúp xác định những thay đổi nghiêm trọng xảy ra ở Tây Âu trong năm 2005 - 2008. Năm 2005, một dòng vô tính mới được phát hiện ở Anh, được gọi là 13_A2 (hoặc “Blue 13”) và được đặc trưng bởi kiểu giao phối A2 , tính hiếu chiến cao và khả năng chống lại phenylamit (Shaw và cộng sự, 2007). Kiểu gen tương tự cũng được tìm thấy trong các mẫu thu thập vào năm 2004 ở Hà Lan và miền bắc nước Pháp, cho thấy rằng nó đã di cư đến Vương quốc Anh từ lục địa châu Âu, có thể với khoai tây giống (Cooke và cộng sự, 2007). Nghiên cứu về bộ gen của các đại diện của dòng vô tính này cho thấy mức độ đa hình cao về trình tự của nó (đến năm 2016, số lượng các biến thể dưới dòng của nó đạt 340) và mức độ biến đổi đáng kể trong mức độ biểu hiện gen, bao gồm cả. gen tác động trong quá trình lây nhiễm cây trồng (Cooke và cộng sự, 2012; Cooke, 2017). Những đặc điểm này, cùng với thời gian gia tăng của giai đoạn dinh dưỡng sinh học, có thể làm tăng tính hiếu chiến của 13_A2 và khả năng lây nhiễm ngay cả các giống khoai tây kháng bệnh mốc sương.
Trong vài năm tới, kiểu gen nhanh chóng lan rộng khắp các nước Tây Bắc Âu (Anh, Ireland, Pháp, Bỉ, Hà Lan, Đức) với sự dịch chuyển đồng thời của các kiểu gen trội trước đó 1_A1, 2_A1, 8_A1 (Montarry và cộng sự, 2010; Gisi và cộng sự. , 2011; Van den Bosch và cộng sự, 2011; Cooke, 2015; Cooke, 2017). Theo trang web www.euroblight.net, tỷ lệ 13_A2 trong dân số của các quốc gia này đạt 60-80% và hơn thế nữa; sự hiện diện của kiểu gen này cũng đã được ghi nhận ở một số nước Đông và Nam Âu. Tuy nhiên, vào năm 2009-2012. 13_A2 mất vị trí thống trị ở Anh và Pháp, nhường cho dòng 6_A1 (8_A1 ở Ireland), và ở Hà Lan và Bỉ, nó được thay thế một phần bởi các kiểu gen 1_A1, 6_A1 và 33_A2 (Cooke và cộng sự, 2012; Cooke, 2017; Stellingwerf, 2017).
Cho đến nay, khoảng 70% dân số Tây Âu của P. infestans là đơn dòng. Theo trang web www.euroblight.net, các kiểu gen trội ở các nước Tây Bắc Âu (Anh, Pháp,
Hà Lan, Bỉ) vẫn còn, với tỷ lệ xấp xỉ bằng nhau, 13_A2 và 6_A1, và trường hợp thứ hai thực tế không xảy ra bên ngoài khu vực được chỉ định (ngoại trừ Ireland), nhưng đã có ít nhất 58 dòng phụ (Cooke, 2017). Các biến thể 13_A2 hiện diện với số lượng đáng chú ý ở Đức, và cũng được quan sát thấy lẻ tẻ ở các quốc gia Trung và Nam Âu. Kiểu gen 1_A1 chiếm một phần đáng kể trong dân số của Bỉ và một phần là Hà Lan và Pháp. Kiểu gen 8_A1 đã ổn định trong dân số châu Âu ở mức 3-6%, ngoại trừ Ireland, nơi nó vẫn giữ vị trí dẫn đầu và được chia thành hai dòng phụ (Stellingwerf, 2017). Cuối cùng, vào năm 2016, sự gia tăng tần suất xuất hiện của các kiểu gen mới 36_A2 và 37_A2, được ghi nhận lần đầu vào năm 2013-2014, đã được ghi nhận; cho đến nay, những kiểu gen này được tìm thấy ở Hà Lan và Bỉ và một phần ở Pháp và Đức, cũng như ở phần phía nam của Vương quốc Anh (Cooke, 2017). Khoảng 20-30% dân số Tây Âu được biểu hiện bằng các kiểu gen duy nhất hàng năm.
Không giống như Tây Âu, vào thời điểm kiểu gen 13_A2 xuất hiện, các quần thể ở Bắc Âu (Thụy Điển, Na Uy, Đan Mạch, Phần Lan) không được biểu thị bằng các dòng vô tính, mà là một số lượng lớn các kiểu gen duy nhất (Brurberg và cộng sự,
2011). Trong thời kỳ lan rộng tích cực của 13_A2 ở Tây Âu, sự hiện diện của kiểu gen này ở Scandinavia đã không được ghi nhận cho đến năm 2011, khi nó lần đầu tiên được phát hiện ở Bắc Jutland (Đan Mạch), nơi chủ yếu là các giống khoai tây công nghiệp được trồng với việc sử dụng tích cực chất chứa metalaxyl. thuốc diệt nấm (Nielsen và cộng sự, 2014). Theo www.euroblight.net, kiểu gen 13_A2 cũng được phát hiện trong một số mẫu từ Na Uy và Đan Mạch vào năm 2014 và trong một số mẫu của Na Uy vào năm 2016; Ngoài ra, vào năm 2013, sự hiện diện của kiểu gen 6_A1 với một số lượng nhỏ đã được ghi nhận ở Phần Lan. Nguyên nhân chính dẫn đến sự thất bại của 13_A2 và các dòng vô tính khác trong cuộc chinh phục Scandinavia được coi là sự khác biệt về khí hậu của khu vực này với các nước Tây Âu.
Ngoài thực tế là mùa hè mát mẻ và mùa đông lạnh giá thúc đẩy sự tồn tại của không quá nhiều sợi nấm sinh dưỡng dưới dạng bào tử (Sjöholm và cộng sự, 2013), việc đóng băng đất vào mùa đông (thường không xảy ra ở các nước ấm hơn ở Tây Âu) góp phần đồng bộ hóa quá trình nảy mầm và gieo trồng bào tử. khoai tây, giúp tăng cường vai trò của chúng như một nguồn lây nhiễm chính (Brurberg et al., 2011). Cũng cần lưu ý rằng, ở các điều kiện phía Bắc, sự phát triển của nhiễm trùng từ bào tử trứng vượt xa sự phát triển của nhiễm trùng củ, điều này cuối cùng ngăn cản sự thống trị của các dòng vô tính thậm chí còn hung hãn hơn nhưng đã phát triển sau này (Yuen, 2012). Cấu trúc của các quần thể P. infestans được nghiên cứu nhiều nhất ở các nước Đông Âu (Ba Lan, các nước Baltic) rất giống với ở Scandinavia.
Cả hai kiểu giao phối cũng có ở đây, và phần lớn các kiểu gen được xác định bằng phân tích SSR là duy nhất (Chmielarz và cộng sự, 2014; Runno-Paurson và cộng sự, 2016). Cũng như ở Bắc Âu, sự phân bố của các dòng vô tính (chủ yếu thuộc kiểu gen 13_A2) trên thực tế không ảnh hưởng đến các quần thể địa phương của mầm bệnh, nơi vẫn giữ được mức độ đa dạng cao mà không có các dòng trội rõ rệt.
Sự hiện diện của 13_A2 đôi khi được quan sát thấy trên các ruộng trồng các giống khoai tây thương mại. Ở Nga, tình hình cũng đang diễn biến theo chiều hướng tương tự. Phân tích tế bào vi mô của các chủng P. infestans được thu thập trong năm 2008-2011 ở 10 khu vực khác nhau của phần châu Âu của Nga, cho thấy mức độ đa dạng kiểu gen cao và không có sự trùng hợp hoàn toàn với các dòng vô tính châu Âu (Statsyuk và cộng sự, 2014). Vài năm sau, một nghiên cứu về các mẫu P. infestans được thu thập ở vùng Leningrad vào năm 2013-2014 cho thấy sự khác biệt đáng kể giữa chúng và các kiểu gen từ vùng này được xác định trong nghiên cứu trước đó. Trong cả hai nghiên cứu, không có kiểu gen Tây Âu nào được tìm thấy (Beketova và cộng sự, 2014; Kuznetsova và cộng sự, 2016).
Sự đa dạng di truyền cao của các quần thể P. infestans ở Đông Âu và sự vắng mặt của các dòng vô tính trội ở chúng có thể liên quan đến một số lý do. Thứ nhất, cũng như ở Bắc Âu, điều kiện khí hậu của các quốc gia được coi là góp phần hình thành bào tử trứng là nguồn lây nhiễm chính (Ulanova và cộng sự, 2010; Chmielarz và cộng sự, 2014). Thứ hai, một tỷ lệ đáng kể khoai tây được sản xuất ở các nước này được trồng trong các trang trại tư nhân nhỏ, thường được bao quanh bởi rừng hoặc các chướng ngại vật khác đối với sự di chuyển tự do của vật chất lây nhiễm (Chmielarz và cộng sự, 2014). Theo quy luật, khoai tây trồng trong điều kiện như vậy thực tế không được xử lý bằng hóa chất và việc lựa chọn giống dựa trên khả năng kháng bệnh mốc sương của chúng, tức là không có áp lực chọn lọc đối với tính hiếu chiến và khả năng kháng metalaxyl, điều này làm mất đi lợi thế của các kiểu gen kháng thuốc, chẳng hạn như 13_A2 so với các kiểu gen khác (Chmielarz và cộng sự, 2014). Cuối cùng, do diện tích đất nhỏ, chủ nhân của chúng thường không thực hiện luân canh, trồng khoai tây trong nhiều năm ở cùng một nơi, điều này góp phần tích lũy một loại vi sinh vật đa dạng về mặt di truyền (Runno-Paurson et al., 2016; Elansky, 2015; Elansky et al. ., 2015).
Châu Á
Cho đến gần đây, cấu trúc của quần thể P. infestans ở châu Á vẫn còn tương đối kém hiểu biết. Người ta đã biết rằng nó được biểu hiện chủ yếu bởi các dòng vô tính, và ảnh hưởng của sự tái tổ hợp hữu tính đến sự xuất hiện của các kiểu gen mới là rất nhỏ. Vì vậy, ví dụ, vào năm 1997-1998. Ở phần châu Á của Nga (Siberia và Viễn Đông), quần thể mầm bệnh chỉ được biểu hiện bởi ba kiểu gen với kiểu gen SIB-1 chiếm ưu thế (Elansky và cộng sự, 2001). Sự hiện diện của các dòng mầm bệnh vô tính đã được chứng minh ở các nước như Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, Philippines và Đài Loan (Koh et al., 1994; Chen et al., 2009). Dòng vô tính US-1 thống trị trên một vùng lãnh thổ rộng lớn của Châu Á vào cuối những năm 90 - đầu những năm 2000. hầu như ở khắp mọi nơi bắt đầu bị thay thế bởi các kiểu gen khác, đến lượt nó, nhường chỗ cho những kiểu gen mới. Trong hầu hết các trường hợp, những thay đổi về cấu trúc và thành phần của quần thể ở các nước châu Á có liên quan đến sự di cư của các kiểu gen mới từ bên ngoài. Do đó, ở Nhật Bản, ngoại trừ kiểu gen JP-3, tất cả các kiểu gen Nhật Bản khác xuất hiện sau US-1 (JP-1, JP-2, JP-3) đều ít nhiều có nguồn gốc bên ngoài đã được chứng minh (Akino và cộng sự, 2011) ... Ở Trung Quốc, hiện có ba quần thể mầm bệnh chính với sự phân chia địa lý rõ ràng; Không có hoặc rất yếu dòng gen giữa các quần thể này (Guo và cộng sự, 2010; Li và cộng sự, 2013b). Kiểu gen 13_A2 xuất hiện trên lãnh thổ Trung Quốc ở các tỉnh phía nam của nó (Vân Nam và Tứ Xuyên) vào năm 2005-2007 và vào năm 2012-1014. cũng được nhìn thấy ở phía đông bắc của đất nước (Li et al., 2013b). Ở Ấn Độ, 13_A2 có lẽ xuất hiện cùng lúc với Trung Quốc, nhiều khả năng là khoai tây giống bị nhiễm bệnh (Chowdappa và cộng sự, 2015), và trong năm 2009-2010. đã gây ra dịch bệnh mốc sương nghiêm trọng trên cà chua ở miền Nam đất nước, sau đó lây lan sang khoai tây và vào năm 2014 đã gây ra sự bùng phát bệnh mốc sương ở Tây Bengal, dẫn đến sự điêu đứng và tự sát của nhiều nông dân địa phương (Fry, 2016).
Châu phi
Cho đến 2008-2010 các nghiên cứu có hệ thống về P. infestans ở các nước châu Phi đã không được thực hiện. Hiện tại, quần thể P. infestans ở Châu Phi có thể được chia thành hai nhóm và sự phân chia này rõ ràng gắn liền với thực tế nhập khẩu khoai tây giống từ Châu Âu.
Ở Bắc Phi, nơi tích cực nhập khẩu khoai tây giống từ châu Âu, kiểu giao phối A2 được đại diện rộng rãi ở hầu hết các khu vực, điều này cung cấp khả năng lý thuyết về sự xuất hiện của các kiểu gen mới là kết quả của sự tái tổ hợp hữu tính (Corbière et al., 2010; Rekad et al., 2017). Ngoài ra, ở Algeria, sự hiện diện của các kiểu gen 13_A2, 2_A1 và 23_A1 được ghi nhận với sự thống trị rõ rệt của kiểu gen đầu tiên, cũng như giảm dần tỷ lệ các kiểu gen duy nhất đến khi biến mất hoàn toàn (Rekad và cộng sự, 2017). Trái ngược với phần còn lại của khu vực, ở Tunisia (ngoại trừ phía đông bắc của đất nước), quần thể mầm bệnh được đại diện chủ yếu bởi kiểu giao phối A1 (Harbaoui và cộng sự, 2014).
Dòng vô tính NA-01 chiếm ưu thế ở đây. Nhìn chung, tỷ lệ dòng vô tính trong quần thể chỉ là 43%. Ở Đông và Nam Phi, nơi khối lượng nhập khẩu hạt giống rất nhỏ (Fry và cộng sự, 2009), P. infestans chỉ được đại diện bởi hai dòng vô tính A1 là US-1 và KE-1, và dòng sau tích cực thay thế dòng trước trên khoai tây ( Pule và cộng sự, 2012; Njoroge và cộng sự, 2016). Cho đến nay, cả hai kiểu gen này đều có một số biến thể phụ dòng đáng chú ý.
Úc
Báo cáo đầu tiên về bệnh mốc sương trên khoai tây ở Úc có từ năm 1907, và bệnh biểu sinh đầu tiên, có lẽ là do mưa lớn trong những tháng mùa hè, xảy ra vào năm 1909-1911. (Drenth và cộng sự, 2002). Tuy nhiên, nhìn chung bệnh mốc sương không có ý nghĩa kinh tế đáng kể đối với đất nước. Bệnh mốc sương bùng phát lẻ tẻ do điều kiện thời tiết cung cấp độ ẩm cao, xảy ra không quá 5-7 năm một lần và khu trú chủ yếu ở miền bắc Tasmania và miền trung Victoria. Liên quan đến những điều trên, các ấn phẩm dành cho nghiên cứu về cấu trúc của quần thể P. infestans ở Úc hầu như không có. Thông tin mới nhất hiện có là từ 1998-2000. (Drenth và cộng sự, 2002). Theo các tác giả, quần thể Victoria là dòng vô tính US-1.3, đã gián tiếp xác nhận sự di cư của kiểu gen này từ Hoa Kỳ. Các mẫu vật ở Tasmania được phân loại là AU-3, khác với các kiểu gen có mặt tại thời điểm đó ở các khu vực khác trên thế giới.
Đặc điểm của sự phát triển của bệnh mốc sương ở Nga
Ở châu Âu, sự lây nhiễm được đưa vào các củ giống bị bệnh, bào tử trứng sống quá lâu trong đất, cũng như động vật bào thai do gió mang đến từ các cây trồng từ củ bị chết trong các cánh đồng năm ngoái (cây "tình nguyện"), hoặc trên các đống bị tiêu hủy đánh dấu để lưu trữ các loại củ. Trong số này, cây trồng trên đống củ bỏ đi được coi là nguồn lây nhiễm nguy hiểm nhất. ở đó, số lượng củ nảy mầm thường đáng kể, và động vật bào tử có thể được mang từ chúng qua một quãng đường dài. Các nguồn còn lại (bào tử, thực vật "tình nguyện") không quá nguy hiểm, bởi vì Không có thói quen trồng cây trên cùng một cánh đồng thường xuyên hơn 3-4 năm một lần. Sự lây nhiễm từ củ giống bị bệnh cũng rất ít do hệ thống kiểm soát chất lượng hạt giống tốt.
Nói chung, số lượng chất cấy trong quần thể châu Âu là hạn chế, và do đó sự gia tăng của dịch bệnh khá chậm và có thể được kiểm soát thành công bằng cách sử dụng thuốc diệt nấm hóa học. Nhiệm vụ chính trong điều kiện châu Âu là chống lại sự lây nhiễm trong giai đoạn bắt đầu phát tán hàng loạt động vật bào tử từ các cây bị ảnh hưởng.
Ở Nga, tình hình hoàn toàn khác. Hầu hết khoai tây và cà chua được trồng trong các khu vườn tư nhân nhỏ; Các biện pháp bảo vệ hoặc hoàn toàn không được thực hiện đối với chúng, hoặc các biện pháp xử lý diệt nấm được thực hiện với số lượng không đủ và bắt đầu sau khi xuất hiện bệnh mốc sương trên ngọn. Kết quả là, các vườn rau tư nhân đóng vai trò là nguồn lây nhiễm chính, từ đó động vật bào thai được gió mang sang rừng trồng thương mại. Điều này được xác nhận qua các quan sát trực tiếp của chúng tôi tại các vùng Moscow, Bryansk, Kostroma, Ryazan: thiệt hại đối với cây trồng trong các khu vườn tư nhân được quan sát thấy ngay cả trước khi bắt đầu xử lý thuốc diệt nấm đối với rừng trồng thương mại. Sau đó, dịch bệnh trên các cánh đồng lớn được kiềm chế bằng cách sử dụng các chế phẩm diệt nấm, trong khi ở các vườn tư nhân có sự phát triển nhanh chóng của bệnh mốc sương.
Trong trường hợp các biện pháp xử lý rừng trồng thương mại không đúng hoặc "tốn kém", các ổ bệnh mốc sương xuất hiện trên đồng ruộng; sau đó họ đang tích cực phát triển, bao phủ các khu vực rộng lớn hơn bao giờ hết (Elansky, 2015). Sự lây nhiễm trong vườn tư nhân có ảnh hưởng đáng kể đến dịch bệnh trên ruộng thương phẩm. Ở tất cả các vùng trồng khoai tây của Nga, diện tích khoai tây trong vườn tư nhân lớn hơn nhiều lần so với tổng diện tích ruộng của các nhà sản xuất lớn. Trong môi trường như vậy, các vườn rau tư nhân có thể được xem như một nguồn cung cấp chất cấy toàn cầu cho các cánh đồng thương mại. Chúng ta hãy cố gắng xác định những đặc tính đó là đặc trưng của kiểu gen của các chủng trong vườn tư nhân.
Trồng khoai tây không hạt và kiểm dịch kiểm dịch, hạt cà chua thu được từ các nhà sản xuất nước ngoài đáng ngờ, trồng khoai tây và cà chua lâu dài trên cùng một khu vực, xử lý thuốc diệt nấm không đúng cách hoặc hoàn toàn không có chúng dẫn đến bệnh biểu sinh nghiêm trọng trong khu vực tư nhân, kết quả là miễn phí lai, lai và sự hình thành bào tử trong vườn tư nhân. Kết quả là, sự đa dạng kiểu gen rất cao của mầm bệnh được quan sát thấy, khi hầu hết các chủng đều là duy nhất về kiểu gen của nó (Elansky và cộng sự, 2001, 2015). Trồng khoai tây giống có nguồn gốc di truyền khác nhau sẽ không làm xuất hiện các dòng vô tính chuyên tấn công một giống cụ thể. Các chủng được chọn trong trường hợp như vậy được phân biệt bởi tính linh hoạt của chúng so với các giống bị ảnh hưởng, hầu hết chúng có số lượng gen độc lực gần với số lượng tối đa. Điều này rất khác so với hệ thống “dòng vô tính” đặc trưng cho cánh đồng lớn của các doanh nghiệp nông nghiệp với hệ thống phòng trừ bệnh mốc sương được lắp đặt hợp lý. "Dòng vô tính" (khi tất cả các dòng mầm bệnh mốc sương trên đồng ruộng được đại diện bởi một hoặc nhiều kiểu gen) phổ biến ở các quốc gia mà việc trồng khoai tây được thực hiện độc quyền bởi các trang trại lớn: Mỹ, Hà Lan, Đan Mạch, v.v. Ở Anh, Ireland, Ba Lan, nơi các thửa hộ gia đình cũng phổ biến rộng rãi trồng khoai tây, cũng có sự đa dạng về kiểu gen cao hơn trong các khu vườn riêng. Vào cuối thế kỷ 20, "dòng vô tính" đã phổ biến ở các vùng châu Á và Viễn Đông của Nga (Elansky và cộng sự, 2001), điều này rõ ràng là do việc sử dụng các giống khoai tây giống nhau để trồng riêng. Gần đây, tình hình ở những vùng này cũng bắt đầu thay đổi theo hướng gia tăng sự đa dạng về kiểu gen của quần thể.
Việc thiếu các biện pháp xử lý thâm canh bằng các chế phẩm diệt nấm gây ra một hậu quả trực tiếp khác - không có sự tích tụ của các chủng kháng thuốc trong vườn. Thật vậy, kết quả của chúng tôi cho thấy rằng các chủng kháng metalaxyl được tìm thấy trong vườn tư nhân ít hơn đáng kể so với trồng thương mại.
Việc trồng khoai tây và cà chua gần nhau, điển hình cho vườn tư nhân, tạo điều kiện thuận lợi cho sự di chuyển của các chủng giữa các loại cây trồng này, do đó, trong thập kỷ qua, trong số các chủng được phân lập từ khoai tây, tỷ lệ các chủng mang gen kháng các giống cà chua bi (T1), trước đây chỉ đặc trưng cho " cà chua ”. Các chủng mang gen T1 trong hầu hết các trường hợp đều có tính hung hăng cao đối với cả khoai tây và cà chua.
Những năm gần đây, bệnh mốc sương trên cà chua bắt đầu xuất hiện nhiều vụ sớm hơn trên khoai tây. Cây con cà chua có thể bị nhiễm bởi bào tử trong đất, hoặc bào tử có trong hạt cà chua hoặc bám vào chúng (Rubin et al., 2001). Trong 15 năm qua, một số lượng lớn hạt giống đóng gói rẻ tiền, chủ yếu là nhập khẩu, đã xuất hiện trong các cửa hàng, và hầu hết các hộ sản xuất nhỏ đã chuyển sang sử dụng. Hạt giống có thể mang các chủng có kiểu gen đặc trưng cho vùng sinh trưởng của chúng. Trong tương lai, những kiểu gen này được đưa vào quá trình hữu tính trong vườn tư nhân, điều này dẫn đến sự xuất hiện của những kiểu gen hoàn toàn mới.
Như vậy, có thể nói rằng vườn tư nhân là một “nồi nấu ăn” toàn cầu, trong đó, do sự trao đổi vật chất di truyền, các kiểu gen hiện có được xử lý và các kiểu gen hoàn toàn mới xuất hiện. Hơn nữa, việc lựa chọn chúng diễn ra trong những điều kiện rất khác so với những điều kiện được tạo ra cho khoai tây trong các trang trại lớn: không có máy ép thuốc diệt nấm, sự đồng đều về chủng loại của các cây trồng, sự chiếm ưu thế của các cây bị ảnh hưởng bởi các dạng nhiễm vi rút và vi khuẩn khác nhau, gần với cà chua và bọ đêm, khả năng lai giống tích cực và hình thành bào tử để bào tử trứng hoạt động như một nguồn lây nhiễm cho năm tiếp theo.
Tất cả điều này dẫn đến sự đa dạng về kiểu gen rất cao của các quần thể ở sân sau. Trong điều kiện biểu sinh, bệnh mốc sương lây lan rất nhanh trong các vườn rau và một lượng lớn bào tử được giải phóng, chúng bay đến các vườn trồng thương mại gần đó. Tuy nhiên, khi đã thâm nhập vào các cánh đồng thương mại với hệ thống công nghệ nông nghiệp và hóa chất bảo vệ chính xác, các bào tử đã đến gần như không có cơ hội để bắt đầu biểu sinh trên đồng ruộng, do không có các dòng vô tính kháng thuốc trừ nấm và đặc biệt cho giống được canh tác.
Một nguồn khác của chất cấy sơ cấp có thể là củ bị bệnh bị mắc kẹt trong cây con thương mại. Theo quy luật, những củ này được trồng trên những cánh đồng có công nghệ nông nghiệp tốt và được bảo vệ bằng hóa chất thâm canh. Kiểu gen của các dòng phân lập lây nhiễm trên củ thích nghi với sự phát triển của giống của chúng. Những chủng này nguy hiểm hơn đáng kể khi trồng đại trà so với chủng có nguồn gốc từ vườn tư nhân. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng ủng hộ giả định này. Các quần thể được phân lập từ các cánh đồng lớn với biện pháp bảo vệ bằng hóa chất được tiến hành đúng cách và công nghệ nông nghiệp tốt không khác nhau về mức độ đa dạng kiểu gen cao. Thường thì đây là một số dòng vô tính có tính hung dữ cao.
Các chủng từ vật liệu hạt giống thương mại có thể xâm nhập vào quần thể trong vườn rau và tham gia vào các quá trình diễn ra trong đó. Tuy nhiên, trong vườn rau, khả năng cạnh tranh của chúng sẽ thấp hơn nhiều so với ruộng thương mại, và chúng sẽ sớm không còn tồn tại ở dạng dòng vô tính, nhưng gen của chúng có thể được sử dụng trong quần thể “vườn”.
Sự lây nhiễm phát triển trên cây "tình nguyện" và trên đống củ đã được tiêu hủy trong quá trình thu hoạch không liên quan đến Nga, bởi vì Tại các vùng trồng khoai tây chính của Nga, người ta quan sát thấy sự đóng băng sâu của đất vào mùa đông và cây trồng từ củ đã trú đông trong đất hiếm khi phát triển. Hơn nữa, như các thí nghiệm của chúng tôi cho thấy, mầm bệnh mốc sương không tồn tại ở nhiệt độ âm ngay cả trên các củ vẫn còn khả năng sống. Ở vùng đất khô cằn, nơi trồng khoai tây sớm, bệnh mốc sương khá hiếm do mùa sinh trưởng khô và nóng.
Do đó, chúng tôi hiện đang quan sát sự phân chia các quần thể P. infestans thành các quần thể “ruộng” và “vườn”. Tuy nhiên, trong những năm gần đây, người ta đã quan sát thấy các quá trình dẫn đến sự hội tụ và xâm nhập của các kiểu gen từ các quần thể này.
Trong số đó, người ta có thể ghi nhận sự gia tăng chung về trình độ hiểu biết của các hộ sản xuất nhỏ, sự xuất hiện của các gói khoai tây giống nhỏ với giá cả phải chăng, sự tràn lan của các chế phẩm diệt nấm trong các gói nhỏ và người dân không còn sợ "hóa chất".
Tình huống nảy sinh khi, nhờ hoạt động tích cực của một nhà cung cấp, toàn bộ làng được trồng các loại củ giống của cùng một loại và được cung cấp các gói nhỏ thuốc trừ sâu giống nhau. Có thể giả định rằng khoai tây cùng loại sẽ được tìm thấy trên các đồn điền thương mại gần đó.
Mặt khác, một số công ty kinh doanh thuốc bảo vệ thực vật đang xúc tiến các chương trình xử lý hóa chất “ngân sách”. Trong trường hợp này, số lượng các biện pháp xử lý được khuyến cáo bị đánh giá thấp và các loại thuốc trừ bệnh rẻ nhất được cung cấp, và sự nhấn mạnh không phải là ngăn chặn sự phát triển của bệnh mốc sương cho đến khi cắt ngọn, mà là sự trì hoãn nhất định trong biểu sinh để tăng năng suất. Các kế hoạch như vậy là hợp lý về mặt kinh tế khi trồng khoai tây kho từ nguyên liệu hạt giống cấp thấp, khi về nguyên tắc không có vấn đề gì về việc thu được năng suất cao. Tuy nhiên, trong trường hợp này, ngược lại với các quần thể trong vườn, nền tảng di truyền được cấp bằng của khoai tây góp phần vào việc lựa chọn các chủng tộc sinh lý cụ thể, rất nguy hiểm cho giống này.
Nhìn chung, xu hướng hội tụ của các phương pháp sản xuất khoai tây “vườn” và “ruộng” đối với chúng ta dường như khá nguy hiểm. Để ngăn chặn những hậu quả tiêu cực của chúng, cả trong lĩnh vực gia đình và thương mại, cần phải kiểm soát cả việc phân loại khoai tây giống và phạm vi thuốc diệt nấm được cung cấp cho các chủ sở hữu tư nhân đóng gói nhỏ, cũng như theo dõi các chương trình bảo vệ khoai tây và việc sử dụng các chế phẩm diệt nấm trong lĩnh vực thương mại.
Trong các khu vực của khu vực tư nhân, không chỉ có bệnh mốc sương mà còn cả nấm Alternaria phát triển thâm canh. Hầu hết các chủ sở hữu của các mảnh đất tư nhân không thực hiện các biện pháp đặc biệt để bảo vệ chống lại Alternaria, nhầm lẫn sự phát triển của Alternaria với sự héo rũ tự nhiên của ngọn hoặc sự phát triển của bệnh mốc sương. Do đó, với sự phát triển ồ ạt của Alternaria trên các giống mẫn cảm, các mảnh đất hộ gia đình có thể đóng vai trò là nguồn cung cấp chất cấy cho rừng trồng thương mại.
Cơ chế biến đổi
Quá trình đột biến
Vì sự xuất hiện đột biến là một quá trình ngẫu nhiên xảy ra với tần số thấp nên việc xuất hiện đột biến ở bất kỳ locus nào phụ thuộc vào tần số đột biến của locus này và kích thước quần thể. Khi nghiên cứu tần số đột biến của các chủng P. infestans, người ta thường xác định số lượng khuẩn lạc phát triển trên môi trường dinh dưỡng chọn lọc sau khi xử lý bằng các đột biến hóa học hoặc vật lý. Như có thể thấy từ dữ liệu được trình bày trong Bảng 8, tần suất đột biến của cùng một dòng tại các locus khác nhau có thể khác nhau theo một số bậc của mức độ. Tần suất đột biến cao về khả năng kháng metalaxyl có thể là một trong những lý do tích tụ các chủng kháng với nó trong tự nhiên.
Tần số đột biến tự phát hoặc đột biến cảm ứng, được tính toán trên cơ sở các thí nghiệm trong phòng thí nghiệm, không phải lúc nào cũng tương ứng với các quá trình xảy ra trong quần thể tự nhiên, vì những lý do sau:
1. Với sự phân hạch hạt nhân không đồng bộ, không thể ước tính tần số đột biến mỗi lần tạo hạt nhân. Vì vậy, hầu hết các thí nghiệm chỉ cung cấp thông tin trực tiếp về tần số đột biến, mà không phân biệt giữa hai sự kiện đột biến và một sự kiện sau nguyên phân.
2. Đột biến một bước thường làm giảm sự cân bằng của hệ gen, do đó, cùng với sự tiếp thu một tính chất mới, thể trạng chung của sinh vật giảm. Hầu hết các đột biến thu được trong thực nghiệm đều có tính hung hăng giảm và không được ghi nhận trong các quần thể tự nhiên. Do đó, hệ số tương quan giữa mức độ kháng thuốc của P. infestans đột biến đối với thuốc trừ nấm phenylamide và tốc độ phát triển trên môi trường nhân tạo là trung bình (-0,62), và khả năng kháng thuốc diệt nấm và tính xâm thực trên lá khoai tây (-0,65) (Derevyagina et al. , 1993), cho thấy thể lực thấp của những người đột biến. Các đột biến về khả năng kháng dimethomorph cũng đi kèm với việc giảm mạnh khả năng sống (Bagirova và cộng sự, 2001).
3. Hầu hết các đột biến tự phát và đột biến cảm ứng đều là đột biến lặn và không biểu hiện ra kiểu hình trong thí nghiệm, nhưng tạo thành nguồn dự trữ biến dị trong quần thể tự nhiên. Các chủng đột biến được phân lập trong các thí nghiệm trong phòng thí nghiệm mang các đột biến trội hoặc bán trội (Kulish và Dyakov, 1979). Rõ ràng, lưỡng bội hạt nhân giải thích những nỗ lực không thành công trong việc thu được các đột biến dưới tác động của bức xạ UV có độc lực trên các giống đã kháng trước đó (McKee, 1969). Theo tính toán của tác giả, những đột biến như vậy có thể xảy ra với tần suất nhỏ hơn 1: 500000. Sự chuyển đột biến lặn sang trạng thái đồng hợp tử biểu hiện kiểu hình có thể xảy ra do tái tổ hợp hữu tính hoặc vô tính (xem bên dưới). Tuy nhiên, ngay cả trong trường hợp này, đột biến có thể bị che lấp bởi các alen trội của nhân kiểu hoang trong sợi nấm hình nón (đa nhân) và chỉ được cố định về mặt kiểu hình trong quá trình hình thành bào tử đơn nhân.
Bảng 8. Tần suất đột biến của P. infestans thành các chất ức chế sinh trưởng dưới tác dụng của nitrosomethylurea (Dolgova, Dyakov, 1986; Bagirova et al., 2001)
Kết nối | Tần số đột biến |
Oxytetracycline | 6,9 10 x-8 |
Blasticidin S | 7,2 x 10-8 |
Streptomycin | 8,3 x10-8 |
Trichothecin | 1,8 10 x-8 |
Cycloheximide | 2,1 10 x-8 |
Daaconil | <4 x 10-8 |
Dimethomorph | 6,3 10 x-7 |
Metalaxil | 6,9 10 x-6 |
Kích thước quần thể cũng đóng một vai trò quyết định trong việc xuất hiện các đột biến tự phát. Trong những quần thể rất lớn, trong đó số lượng tế bào N> 1 / a, trong đó a là tỷ lệ đột biến, đột biến không còn là hiện tượng ngẫu nhiên (Kvitko, 1974).
Các tính toán cho thấy rằng với một ruộng khoai tây bị nhiễm trung bình (35 đốm trên mỗi cây), 8x1012 bào tử được hình thành hàng ngày trên một ha (Dyakov và Suprun, 1984). Rõ ràng, các quần thể như vậy chứa tất cả các đột biến được cho phép bởi loại trao đổi ở mỗi vị trí. Ngay cả một đột biến hiếm gặp, xảy ra với tần suất 10-9, cũng sẽ được một nghìn cá thể trong số hàng triệu cá thể sống trên một ha ruộng khoai tây mắc phải. Đối với các đột biến xảy ra với tần số cao hơn (ví dụ, 10-6), trong một quần thể như vậy, các đột biến ghép đôi khác nhau có thể xảy ra hàng ngày (đồng thời ở hai locus), tức là quá trình đột biến sẽ thay thế sự tái tổ hợp.
Di cư
Đối với P. infestans, hai kiểu di cư chính được biết đến: đến gần khoảng cách (trong ruộng khoai tây hoặc các ruộng lân cận) bằng cách phát tán động vật bào tử bằng dòng không khí hoặc phun mưa, và di chuyển xa - trồng củ hoặc quả cà chua được vận chuyển. Phương pháp đầu tiên cung cấp cho việc mở rộng trọng tâm của bệnh, phương pháp thứ hai - tạo ra các ổ mới ở những nơi xa vùng chính.
Sự lây lan của bệnh nhiễm vào củ và quả cà chua không chỉ góp phần làm xuất hiện bệnh ở những nơi mới, mà còn là nguồn gốc chính của sự đa dạng di truyền trong quần thể. Ở vùng Matxcova, khoai tây được trồng, được đưa từ các vùng khác nhau của Nga và Tây Âu. Những quả cà chua được mang đến từ các vùng phía nam của Nga (vùng Astrakhan, vùng Krasnodar, Bắc Caucasus). Hạt cà chua, cũng có thể là nguồn lây nhiễm bệnh (Rubin và cộng sự, 2001), cũng được nhập khẩu từ các vùng phía nam của Nga, Trung Quốc, các nước châu Âu và các nước khác.
Theo tính toán của E. Mayr (1974), sự thay đổi di truyền trong quần thể địa phương do đột biến gây ra hiếm khi vượt quá 10-5 trên mỗi locus, trong khi ở quần thể mở, sự trao đổi do ngược dòng của gen ít nhất là 10-3 - 10-4.
Sự di cư trong các củ bị nhiễm bệnh là nguyên nhân dẫn đến sự xâm nhập của P. infestans vào Châu Âu, lây lan đến tất cả các vùng trên thế giới nơi trồng khoai tây; họ đã gây ra những thay đổi dân số nghiêm trọng nhất. Bệnh mốc sương trên khoai tây xuất hiện trên lãnh thổ của Đế quốc Nga gần như đồng thời với sự xuất hiện của nó ở Tây Âu.
Kể từ khi căn bệnh này được ghi nhận lần đầu tiên vào năm 1846-1847 ở các nước Baltic và chỉ trong những năm sau đó lan rộng ở Belarus và các vùng Tây Bắc của Nga, nguồn gốc Tây Âu của nó là rõ ràng. Nguồn gốc đầu tiên của bệnh mốc sương ở Cựu thế giới không quá rõ ràng. Giả thuyết được phát triển bởi Fry và cộng sự (Fry và cộng sự, 1992; Fry, Goodwin, 1995, Goodwin và cộng sự, 1994) cho rằng ký sinh trùng đầu tiên đến từ Mexico đến Bắc Mỹ, nơi nó lây lan trên cây trồng, và sau đó được vận chuyển đến Tây Âu (hình 7).
Kết quả của sự trôi dạt lặp đi lặp lại (tác động kép của "nút thắt cổ chai"), các dòng vô tính đơn lẻ đã đến châu Âu, con cái của chúng đã gây ra đại dịch trên khắp lãnh thổ của Thế giới cũ nơi trồng khoai tây. Để làm bằng chứng cho giả thuyết này, các tác giả trích dẫn, thứ nhất, sự xuất hiện phổ biến của chỉ một kiểu giao phối (A1) và thứ hai, sự đồng nhất về kiểu gen của các chủng được nghiên cứu từ các vùng khác nhau (tất cả chúng đều dựa trên dấu hiệu phân tử, bao gồm 2 locus isozyme, các mẫu dấu vân tay DNA, và cấu trúc của DNA ty thể giống hệt nhau và tương ứng với bản sao US-1 được mô tả ở Hoa Kỳ). Tuy nhiên, một số dữ liệu làm dấy lên nghi ngờ về ít nhất một số điều khoản của giả thuyết đã nêu. Phân tích DNA ty thể của P. infestans được phân lập từ các mẫu khoai tây trên cây cỏ bị nhiễm bệnh trong thời kỳ biểu sinh đầu tiên vào những năm 40 cho thấy chúng khác nhau về cấu trúc của DNA ty thể từ bản sao US-1, do đó, ít nhất là không phải là nguồn lây nhiễm duy nhất ở Châu Âu (Ristaino và cộng sự, 2001).
Tình trạng mốc sương trở lại tồi tệ vào những năm 80 của TK XX. Những thay đổi sau đã xảy ra:
1) Tính hiếu chiến trung bình của quần thể tăng lên, đặc biệt, đã dẫn đến sự lây lan rộng rãi của dạng bệnh mốc sương gây hại nặng nhất - gây hại cho cuống lá và thân.
2) Có một sự thay đổi về thời gian của bệnh mốc sương trên khoai tây - từ cuối tháng Bảy đến đầu tháng Bảy và thậm chí đến cuối tháng Sáu.
3) Kiểu giao phối A2, trước đây không có ở Cựu thế giới, đã trở nên phổ biến.
Những thay đổi này diễn ra trước hai sự kiện: việc sử dụng ồ ạt loại thuốc diệt nấm mới metalaxyl (Schwinn và Staub, 1980) và sự xuất hiện của Mexico như một nước xuất khẩu khoai tây trên thế giới (Niederhauser, 1993). Theo đó, hai lý do dẫn đến sự thay đổi quần thể đã được đưa ra - chuyển đổi kiểu giao phối dưới ảnh hưởng của metalaxyl (Ko, 1994) và sự du nhập ồ ạt các chủng mới với củ bị nhiễm bệnh từ Mexico (Fry và Goodwin, 1995). Mặc dù Ko chỉ thu được sự chuyển đổi lẫn nhau của các kiểu giao phối dưới ảnh hưởng của metalaxyl mà còn trong các công trình được thực hiện trong phòng thí nghiệm của Đại học Tổng hợp Moscow (Savenkova, Chherepennicova-Anikina, 2002), giả thuyết thứ hai vẫn thích hợp hơn. Cùng với sự xuất hiện của kiểu giao phối thứ hai, những thay đổi nghiêm trọng đã diễn ra trong kiểu gen của các chủng P. infestans Nga, bao gồm các gen trung tính (isozyme và RFLP loci), cũng như trong cấu trúc của ADN ty thể. Sự phức tạp của những thay đổi này không thể được giải thích bởi tác động của metalaxyl; đúng hơn, đã có một sự nhập khẩu ồ ạt các chủng mới từ Mexico, chúng hoạt động mạnh hơn (Kato và cộng sự, 1997), đã thay thế các chủng cũ (US-1), trở nên chiếm ưu thế trong quần thể. Sự thay đổi thành phần dân cư châu Âu diễn ra trong một thời gian rất ngắn - từ 1980 đến 1985 (Fry và cộng sự, 1992). Trên lãnh thổ của Liên Xô cũ, “các chủng mới” đã được tìm thấy trong các bộ sưu tập từ Estonia vào năm 1985, tức là sớm hơn ở Ba Lan và Đức (Goodwin và cộng sự, 1994). Lần cuối cùng "chủng cũ US-1" ở Nga được phân lập từ cà chua bị nhiễm bệnh ở vùng Moscow vào năm 1993 (Dolgova et al., 1997). Cũng tại Pháp, các chủng “cũ” được tìm thấy trong các đồn điền cà chua cho đến đầu những năm 90, tức là sau khi chúng biến mất từ lâu trên khoai tây (Leberton và Andrivon, 1998). Những thay đổi ở các dòng P. infestans ảnh hưởng đến nhiều tính trạng, bao gồm cả những đặc điểm có tầm quan trọng thực tiễn cao, và làm tăng tác hại của bệnh mốc sương.
Tái tổ hợp giới tính
Để sự tái tổ hợp hữu tính góp phần vào sự biến đổi, trước hết cần phải có sự hiện diện của hai kiểu giao phối trong quần thể với tỷ lệ gần 1: 1 và thứ hai là sự hiện diện của sự biến đổi quần thể ban đầu.
Tỷ lệ kiểu giao phối rất khác nhau ở các quần thể khác nhau và thậm chí ở các năm khác nhau trong một quần thể (Bảng 9,10, 90). Người ta vẫn chưa biết lý do của những thay đổi mạnh mẽ về tần suất các kiểu giao phối trong quần thể (chẳng hạn như ở Nga hoặc ở Israel vào đầu những năm 2002 của thế kỷ trước), nhưng người ta tin rằng điều này là do sự ra đời của các dòng vô tính cạnh tranh hơn (Cohen, XNUMX).
Một số dữ liệu gián tiếp chỉ ra quá trình tình dục trong những năm nhất định và ở những vùng nhất định:
1) Nghiên cứu các quần thể từ khu vực Mátxcơva cho thấy trong 13 quần thể có tỷ lệ kiểu giao phối A2 nhỏ hơn 10%, tổng đa dạng di truyền được tính cho 0,08 locus isozyme là 14 và trong 2 quần thể có tỷ lệ kiểu A30 vượt quá 0,15%, đa dạng di truyền cao gấp đôi (1999) (Elansky và cộng sự, XNUMX). Như vậy, xác suất giao hợp càng cao thì tính đa dạng di truyền của quần thể càng lớn.
2) Mối quan hệ giữa tỷ lệ kiểu giao phối trong quần thể và cường độ hình thành bào tử được quan sát thấy ở Israel (Cohen và cộng sự, 1997) và ở Hà Lan
(Flier và cộng sự, 2004). Các nghiên cứu của chúng tôi đã chỉ ra rằng, trong các quần thể trong đó các chủng phân lập với kiểu giao phối A2 chiếm 62, 17, 9 và 6%, bào tử trứng được tìm thấy ở 78, 50, 30 và 15% số lá khoai tây được phân tích (có từ 2 đốm trở lên), tương ứng.
Các mẫu có từ 2 đốm trở lên thường chứa bào tử nhiều hơn đáng kể so với các mẫu có 1 đốm (tương ứng là 32 và 14% số mẫu) (Apryshko et al., 2004).
Bào tử phổ biến hơn nhiều ở các lá ở tầng giữa và dưới của cây khoai tây (Mytsa và cộng sự, 2015; Elansky và cộng sự, 2016).
3) Ở một số vùng, người ta đã phát hiện ra các kiểu gen độc nhất, sự xuất hiện của kiểu gen đó liên quan đến sự tái tổ hợp hữu tính. Do đó, ở Ba Lan vào năm 1989 và ở Pháp năm 1990, các chủng đồng hợp tử với glucose-6-
phosphate isomerase (GPI 90/90). Vì trước đây chỉ có 10/90 trường hợp dị hợp tử được gặp trong 100 năm, đồng hợp tử được cho là do tái tổ hợp hữu tính (Sujkowski và cộng sự, 1994). Ở Colombia (Mỹ), các chủng phân lập kết hợp A2 với GPI 100/110 và A1 với GPI 100/100 là phổ biến, nhưng vào cuối vụ mùa 1994 (ngày 16 tháng 9 và ngày 1 tháng 100), các chủng có kiểu gen tái tổ hợp (A110 GPI 2/100 và A100 GPI 1997/XNUMX) (Miller và cộng sự, XNUMX).
4) Trong một số quần thể từ Ba Lan (Sujkowski và cộng sự, 1994) và Bắc Caucasus (Amatkhanova và cộng sự, 2004), sự phân bố của các locus DNA vân tay và các locus protein allozyme tương ứng với sự phân bố Hardy-Weinberg, điều này cho thấy
về tỷ lệ đóng góp của tái tổ hợp hữu tính vào sự biến đổi của quần thể. Ở các vùng khác của Nga, không tìm thấy sự tương ứng với sự phân bố Hardy-Weinberg trong quần thể, nhưng sự hiện diện của sự mất cân bằng liên kết đã được chỉ ra, cho thấy ưu thế của sinh sản vô tính (Elansky và cộng sự, 1999).
5) Đa dạng di truyền (GST) giữa các chủng có kiểu giao phối khác nhau (A1 và A2) thấp hơn giữa các quần thể khác nhau (Sujkowski và cộng sự, 1994), điều này gián tiếp chỉ ra các phép lai hữu tính.
Đồng thời, đóng góp của tái tổ hợp giới tính vào sự đa dạng của quần thể không thể rất cao. Sự đóng góp này đã được tính toán cho các dân số ở khu vực Moscow (Elansky và cộng sự, 1999). Theo tính toán của Lewontin (1979) “sự tái tổ hợp, có thể tạo ra các biến thể mới từ hai locus với tần số không vượt quá sản phẩm của các dị hợp tử của chúng, chỉ có hiệu quả nếu giá trị dị hợp tử cho cả hai alen đã cao”.
Với tỷ lệ của hai kiểu ghép đôi đặc trưng cho vùng Mátxcơva bằng 4: 1, tần số tái tổ hợp sẽ là 0,25. Xác suất để các chủng lai sẽ là dị hợp tử đối với hai trong ba locus isozyme được nghiên cứu trong các quần thể nghiên cứu là 0,01 (2 chủng trong số 177). Do đó, xác suất xuất hiện các dị hợp tử kép do tái tổ hợp không được vượt quá sản phẩm của chúng nhân với xác suất lai (0,25x0,02x0,02) = 10-4, tức là các tái tổ hợp hữu tính thường không thuộc mẫu nghiên cứu của các chủng. Những tính toán này được thực hiện đối với các quần thể từ khu vực Moscow được đặc trưng bởi sự biến động tương đối cao. Trong các quần thể đơn hình như ở Siberi, quá trình hữu tính, ngay cả khi nó xảy ra trong các quần thể riêng biệt, không thể ảnh hưởng đến sự đa dạng di truyền của chúng.
Ngoài ra, P. infestans được đặc trưng bởi sự lệch lạc nhiễm sắc thể thường xuyên trong bệnh meiosis, dẫn đến thể dị bội (Carter và cộng sự, 1999). Những vi phạm như vậy làm giảm khả năng sinh sản của con lai.
Tái tổ hợp vô tính, chuyển gen nguyên phân
Trong các thí nghiệm về sự ghép nối của các chủng P. infestans có đột biến về khả năng kháng với các chất ức chế tăng trưởng khác nhau, người ta đã tìm thấy sự xuất hiện của các chủng sai kháng với cả hai chất ức chế (Shattock và Shaw, 1975; Dyakov, Kuzovnikova, 1974; Kulish, Dyakov
Năm 1979). Các chủng kháng với hai chất ức chế sinh trưởng phát sinh do quá trình dị phân tử của sợi nấm, và trong trường hợp này, chúng phân cắt trong quá trình sinh sản bởi các tế bào động vật đơn nhân (Judelson, Ge Yang, 1998), hoặc không phân cắt ở con cái đơn bội, vì chúng có tứ bội (vì các dòng phân lập ban đầu là lưỡng bội) nhân (K , 1979). Các thể lưỡng bội dị hợp tử phân li với tần số rất thấp do đơn bội hóa, không tiếp hợp nhiễm sắc thể và lai phân bào (Poedinok và cộng sự, 1982). Tần suất của các quá trình này có thể được tăng lên với sự trợ giúp của các hành động nhất định đối với các thể lưỡng bội dị hợp tử (ví dụ, chiếu tia UV lên các bào tử đang nảy mầm).
Mặc dù sự hình thành các cây lai sinh dưỡng có tính kháng kép không chỉ xảy ra trong ống nghiệm mà còn ở các củ khoai tây bị nhiễm hỗn hợp đột biến (Kulish và cộng sự, 1978), nhưng khá khó để đánh giá vai trò của tái tổ hợp vô tính trong việc tạo ra các kiểu gen mới trong quần thể. Tần số hình thành thể phân li do đơn bội, không tiếp hợp nhiễm sắc thể và giảm phân không qua các tác động đặc biệt là không đáng kể (nhỏ hơn 10-3).
Sự xuất hiện của các phân ly đồng hợp tử của các dòng dị hợp tử có thể dựa trên cả giao phối nguyên phân và chuyển đổi gen giảm phân, ở P. sojae xảy ra với tần số 3 x 10-2 đến 5 x 10-5 trên mỗi locus, tùy thuộc vào dòng (Chamnanpunt et al. , 2001).
Mặc dù tần suất xuất hiện của dị bội thể và dị hợp tử lưỡng bội cao bất ngờ (lên tới hàng chục phần trăm), quá trình này chỉ xảy ra khi các mẫu cấy đột biến thu được từ cùng một dòng được ghép nối. Khi sử dụng các chủng khác nhau được phân lập từ tự nhiên, quá trình dị phân tử không xảy ra (hoặc xảy ra với tần suất rất thấp) do sự không tương hợp sinh dưỡng (Poedinok và Dyakov, 1981; Anikina và cộng sự, 1997b; Cherepennikova-Anikina và cộng sự, 2002). Do đó, vai trò của tái tổ hợp vô tính chỉ có thể giảm xuống thành tái tổ hợp nội bào trong các nhân dị hợp tử và chuyển các gen riêng lẻ sang trạng thái đồng hợp tử mà không có quá trình hữu tính. Quá trình này có thể có ý nghĩa dịch tễ học đối với các chủng đột biến gen lặn hoặc nửa trội kháng thuốc diệt nấm. Việc nó chuyển sang trạng thái đồng hợp tử do quá trình sinh sản vô tính sẽ làm tăng sức đề kháng của người mang đột biến (Dolgova, Dyakov, 1986).
Sự xâm nhập của gen
Các loài dị nhân Phytophthora có khả năng giao phối với nhau để hình thành bào tử lai (xem Vorob'eva và Gridnev, 1983; Sansome và cộng sự, 1991; Veld và cộng sự, 1998). Sự lai tạo tự nhiên của hai loài Phytophthora rất hung dữ đến nỗi nó đã giết chết hàng ngàn con báo hoa ở Anh (Brasier và cộng sự, 1999). P. infestans có thể xảy ra với các loài khác thuộc giống (P. erythroseptica, P. nicotianae, P. Cactorum, v.v.) trên cây chủ thông thường và trong đất, nhưng có rất ít thông tin trong tài liệu về khả năng lai tạp giữa các loài đặc trưng. Trong điều kiện phòng thí nghiệm, con lai giữa P. infestans và P. Mirabilis đã được thu được (Goodwin và Fry, 1994).
Bảng 9. Tỷ lệ các chủng P. infestans có kiểu giao phối A2 ở các quốc gia khác nhau trên thế giới trong giai đoạn 1990-2000 (theo số liệu của các nguồn tài liệu mở và các trang web www.euroblight.net, www.eucablight.org)
nước | 1990 | 1991 | 1992 | 1993 | 1994 | 1995 | 1996 | 1997 | 1998 | 1999 | 2000 |
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Belarus | 33 (12) | 34 (29) | |||||||||
Bỉ | 15 (49 *) | 6 (66) | 20 (86) | ||||||||
Ecuador | 0 (13) | 0 (12) | 0 (19) | 0 (21) | 12 (41) | 25 (39) | 15 (75) | 22 (73) | 25 (68) | 0 (35) | |
E-xtô-ni-a | 8 (12) | ||||||||||
Nước Anh | 4 (26) | 3 (630) | 9 (336) | ||||||||
Phần Lan | 0 (15) | 19 (117) | 12 (16) | 21 (447) | 6 (509) | 9 (432) | 43 (550) | ||||
Pháp | 0 (35) | 0 (56) | 0 (83) | 0 (67) | 0 (86) | 2 (135) | 7 (156) | 6 (123) | 0 (73) | 0 (285) | 0 (135) |
Hungary | 72 (32) | ||||||||||
Ireland | 4 (145) | ||||||||||
Bắc. Ireland | 10 (41) | 9 (58) | 1 (106) | 0 (185) | 0 (18) | 0 (56) | 0 (35) | 0 (26) | |||
Hà Lan | 7 (41) | 5 (276) | 24 (377) | 44 (353) | 23 (185) | ||||||
Na Uy | 25 (446) | 28 (156) | 8 (39) | 18 (257) | 38 (197) | ||||||
Peru | 0 (34, 1984-86) | 0 (287, 1997-98) | 0 (112) | 0 (66) | |||||||
Ba Lan | 19 (180) | 21 (142) | 33 (256) | 26 (149) | 35 (70) | ||||||
Scotland | 25 (147) | 11 (163) | 22 (189) | 5 (22) | |||||||
Thụy Điển | 25 (263) | 62 (258) | 49 (163) | ||||||||
Xứ Wales | 0 (16) | 7 (97) | 0 (48) | 0 (25) | |||||||
Hàn Quốc | 36 (42) | 10 (130) | 15 (98) | ||||||||
Trung Quốc | 20 (142, 1995-98) | 0 (6) | 0 (8) | 0 (35) | |||||||
Colombia | 0 (40, 1994-2000) | ||||||||||
Uruguay | 100 (25, 1998-99) | ||||||||||
Morocco | 60 (108, 1997-2000) | 52 (25) | 42 (40) | ||||||||
Serbia | 76 (37) | ||||||||||
Mexico (Toluca) | 28 (292, 1988-89) | 50 (389, 1997-98) |
Bảng 10. Tỷ lệ các chủng P. infestans có kiểu giao phối A2 ở các quốc gia khác nhau trên thế giới trong giai đoạn 2000-2011
nước | 2001 | 2002 | 2003 | 2004 | 2005 | 2006 | 2007 | 2008 | 2009 | 2010 | 2011 |
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Áo | 65 (83) | ||||||||||
Belarus | 42 (78) | ||||||||||
Bỉ | 20 (102 *) | 4 (32) | 50 (14) | 25 (16) | 62 (13) | 54 (26) | 70 (54) | 30 (23) | 29 (35) | 62 (71) | 45 (49) |
Thụy Sĩ | 89 (19) | ||||||||||
Чехия | 35 (31) | 54 (64) | 38 (174) | 12 (80) | |||||||
Đức | 95 (53) | ||||||||||
Đan Mạch | 48 (52) | ||||||||||
Ecuador | 5 (178) | 6 (108) | 9 (121) | 18 (94) | 2 (44) | 0 (66) | 5 (47) | ||||
E-xtô-ni-a | 54 (25) | 0 (24) | 33 (62) | 45 (140) | 25 (100) | 12 (103) | |||||
Nước Anh | 4 (47) | 10 (96) | 31 (55) | 55 (790) | 68 (862) | 70 (552) | 68 (299) | ||||
Phần Lan | 47 (162) | 12 (218) | 42 | ||||||||
Pháp | 0 (186) | 4 (108) | 8 (61) | 22 (103) | 33 (303) | 65 (378) | 74 (331) | 75 (125) | 75 (12) | ||
Hungary | 48 (27) | 48 (90) | 9 | 7 | |||||||
Bắc. Ireland | 0 (38) | 0 (58) | 0 (40) | 0 (24) | 5 (54) | 0 (18) | 27 (578) | 45 (239) | 36 (213) | 82 (60) | 10 (80) |
Hà Lan | 66 (24) | 93 (15) | 91 (11) | ||||||||
Na Uy | 39 (328) | 3 (115) | 12 (19) | ||||||||
Peru | 0 (36) | ||||||||||
Ba Lan | 25 (46) | 10 (30) | 85 (20) | 38 (44) | 75 (66) | 55 (56) | 65 (35) | 72 (81) | 85 (21) | ||
Scotland | 3 (213) | 2 (474) | 24 (135) | 86 (337) | 88 (386) | 74 (172) | |||||
Thụy Điển | 60 (277) | 39 (87) | |||||||||
Xlô-va-ki-a | 0 (36) | 14 (26) | 62 (26) | 0 (26) | |||||||
Xứ Wales | 25 (12) | 68 (106) | 80 (88) | 92 (143) | 75 (45) | ||||||
Hàn Quốc | 46 (26) | ||||||||||
Brazil | 0 (49) | 0 (30) | |||||||||
Trung Quốc | 10 (30) | 0 (6) | 0 (6) | ||||||||
Việt Nam | 0 (294, 2003-04) | ||||||||||
Uganda | 0 (8) |
Động thái thành phần kiểu gen của quần thể
Những thay đổi trong thành phần kiểu gen của quần thể P. infestans có thể xảy ra dưới ảnh hưởng của sự di cư của các dòng vô tính mới từ các vùng khác, các hoạt động nông nghiệp (thay đổi giống, sử dụng thuốc diệt nấm) và điều kiện thời tiết. Các tác động bên ngoài ảnh hưởng đến các dòng vô tính khác nhau ở các giai đoạn khác nhau của chu kỳ sống; do đó, các quần thể hàng năm trải qua những thay đổi theo chu kỳ về tần số của các gen chịu sự chọn lọc, do sự thay đổi vai trò chi phối của sự trôi dạt và chọn lọc gen.
Ảnh hưởng của sự đa dạng
Các giống cây trồng mới với các gen hiệu quả đối với tính kháng dọc (gen R) là một yếu tố chọn lọc mạnh mẽ để chọn ra các dòng vô tính có các gen độc lực bổ sung trong quần thể P. infestans. Khi ở giống khoai tây không có tính kháng đặc hiệu kìm hãm sự phát triển của quần thể mầm bệnh thì quá trình thay thế các dòng trội trong quần thể xảy ra rất nhanh. Vì vậy, sau khi lan rộng ở vùng Moscow giống Domodedovsky có gen kháng R3, tần số dòng vô tính có độc lực đối với giống này tăng từ 0,2 lên 0,82 trong một năm (Dyakov, Derevjagina, 2000).
Tuy nhiên, sự thay đổi tần số của các gen độc lực (kiểu bệnh) trong quần thể xảy ra không chỉ dưới ảnh hưởng của các giống khoai tây được canh tác. Ví dụ, ở Belarus cho đến năm 1977, các dòng vô tính mang gen độc lực 1 và 4 chiếm ưu thế, nguyên nhân là do việc trồng các giống khoai tây có gen kháng R1 và R4 (Dorozhkin, Belskaya, 1979). Tuy nhiên, vào cuối những năm 70 của thế kỷ XX, các dòng vô tính đã xuất hiện với các gen độc lực khác nhau và sự kết hợp của chúng, và các gen kháng bổ sung không bao giờ được sử dụng trong nhân giống khoai tây (các gen độc lực) (Ivanyuk và cộng sự, 2002). Lý do cho sự xuất hiện của những người vô tính như vậy, rõ ràng là do sự di cư đến châu Âu của vật chất lây nhiễm từ Mexico với củ khoai tây. Ở nhà, các dòng vô tính này không chỉ phát triển trên khoai tây trồng mà còn trên các loài hoang dã mang nhiều loại gen kháng thuốc; do đó, sự kết hợp của nhiều gen độc lực trong bộ gen là cần thiết để tồn tại trong những điều kiện đó.
Đối với các giống có tính kháng không đặc hiệu, bằng cách giảm tốc độ sinh sản của mầm bệnh, chúng sẽ làm trì hoãn sự phát triển của quần thể, như đã đề cập, là một hàm số. Vì tính hiếu chiến là đa gen, các dòng vô tính có chứa số lượng gen "tính hiếu chiến" càng nhiều càng tích lũy sớm thì kích thước quần thể càng cao. Do đó, các chủng tộc có tính hiếu chiến cao không phải là sản phẩm của sự thích nghi với các giống được trồng có tính kháng không đặc hiệu, mà ngược lại, có nhiều khả năng được phát hiện trong rừng trồng của các giống nhạy cảm cao là nơi tích tụ bào tử ký sinh.
Do đó, ở Nga, các quần thể P. Infestans hung dữ nhất được tìm thấy trong các khu vực biểu sinh hàng năm (quần thể từ các vùng Sakhalin, Leningrad và Bryansk). Tính hung dữ của những quần thể này hóa ra cao hơn quần thể Mexico (Filippov và cộng sự, 2004).
Ngoài ra, ít bào tử trứng được hình thành trong lá của các giống kháng hơn so với các giống mẫn cảm (Hanson và Shattock, 1998), nghĩa là, tính kháng không đặc hiệu của giống cũng làm giảm khả năng tái tổ hợp của ký sinh trùng và khả năng áp dụng các phương pháp trú đông thay thế.
Ảnh hưởng của thuốc diệt nấm
Thuốc diệt nấm không chỉ làm giảm số lượng nấm phytopathogenic, tức là ảnh hưởng đến các đặc điểm số lượng của quần thể của chúng, nhưng chúng cũng có thể thay đổi tần số của các kiểu gen riêng lẻ, tức là ảnh hưởng đến thành phần chất lượng của quần thể. Trong số các chỉ số quan trọng nhất về sự thay đổi của quần thể dưới ảnh hưởng của thuốc diệt nấm là: thay đổi về khả năng kháng thuốc diệt nấm, thay đổi tính hiếu chiến và độc lực, và thay đổi trong hệ thống nhân giống.
Ảnh hưởng của thuốc diệt nấm đối với sức đề kháng và tính hiếu chiến của quần thể
Mức độ ảnh hưởng này trước hết được xác định bởi loại thuốc diệt nấm được sử dụng, có thể được chia theo điều kiện thành polysite, oligosite và monosite.
Trước đây bao gồm hầu hết các loại thuốc diệt nấm tiếp xúc. Sự kháng thuốc đối với chúng (nếu có thể) được kiểm soát bởi một số lượng lớn các gen biểu hiện rất yếu. Những đặc tính này xác định sự không có những thay đổi có thể nhìn thấy được trong sức đề kháng của quần thể sau khi điều trị bằng thuốc diệt nấm (mặc dù trong một số thí nghiệm, khả năng kháng thuốc đã tăng lên). Quần thể nấm được bảo tồn sau khi phun thuốc trừ nấm tiếp xúc bao gồm hai nhóm chủng:
1) Các chủng được bảo quản trong các khu vực cây trồng không được xử lý bằng thuốc. Do không tiếp xúc với thuốc diệt nấm nên tính hiếu chiến và tính kháng của các chủng này không thay đổi.
2) Các chủng tiếp xúc với thuốc diệt nấm, nồng độ của chúng tại các điểm tiếp xúc thấp hơn gây chết. Như đã đề cập ở trên, sức đề kháng của bộ phận quần thể này cũng không thay đổi, tuy nhiên, do tác dụng gây hại một phần của thuốc diệt nấm ngay cả ở nồng độ sublethal đối với sự trao đổi chất của tế bào nấm, thể trạng chung và thành phần ký sinh của nó, tính hung hăng, giảm (Derevyagina và Dyakov, 1990).
Do đó, ngay cả một bộ phận quần thể chưa chết, tiếp xúc với thuốc trừ nấm cũng có tính hiếu chiến yếu và không thể là nguồn biểu sinh. Do đó, việc xử lý cẩn thận làm giảm tần suất tỷ lệ quần thể không tiếp xúc với thuốc diệt nấm là điều kiện cho sự thành công của các biện pháp bảo vệ. Khả năng kháng thuốc trừ nấm oligosite được kiểm soát bởi một số gen phụ gia.
Sự đột biến của mỗi gen dẫn đến một số sự gia tăng khả năng đề kháng, và mức độ kháng thuốc nói chung là do sự bổ sung của các đột biến đó. Do đó, sự gia tăng điện trở xảy ra theo từng bước. Một ví dụ về sự gia tăng sức đề kháng từng bước là các đột biến trong khả năng kháng thuốc trừ nấm dimethomorph, được sử dụng rộng rãi để bảo vệ khoai tây khỏi bệnh mốc sương. Kháng Dimethomorph là polygenic và phụ gia. Đột biến một bước làm tăng nhẹ sức đề kháng.
Mỗi đột biến tiếp theo làm giảm kích thước mục tiêu và do đó, tần số của các đột biến tiếp theo (Bagirova và cộng sự, 2001). Sự gia tăng sức đề kháng trung bình của quần thể sau nhiều lần xử lý bằng thuốc diệt nấm oligosite xảy ra từng bước và dần dần. Tốc độ của quá trình này được xác định bởi ít nhất ba yếu tố: tần số đột biến gen kháng, hệ số kháng (tỷ lệ giữa liều gây chết của chủng kháng so với chủng nhạy cảm) và ảnh hưởng của đột biến gen kháng đối với thể lực.
Tần suất xuất hiện của mỗi đột biến tiếp theo thấp hơn đột biến trước đó, do đó, quá trình này có đặc điểm giảm dần (Bagirova và cộng sự, 2001). Tuy nhiên, nếu các quá trình tái tổ hợp (hữu tính hoặc vô tính) xảy ra trong một quần thể, thì có thể kết hợp các đột biến bố mẹ khác nhau trong một dòng lai và đẩy nhanh quá trình này. Do đó, các quần thể panmix có khả năng kháng thuốc nhanh hơn so với các quần thể agamic, và sau đó, các quần thể không có rào cản xung đột sinh dưỡng nhanh hơn các quần thể bị chia cắt bởi các rào cản đó. Về vấn đề này, sự hiện diện của các chủng trong các quần thể khác nhau về kiểu giao phối sẽ thúc đẩy quá trình kháng thuốc trừ nấm oligosite.
Yếu tố thứ hai và thứ ba không góp phần vào sự tích tụ nhanh chóng của các chủng kháng dimethomorph trong quần thể. Mỗi đột biến tiếp theo làm tăng gấp đôi khả năng kháng thuốc, điều này không đáng kể, đồng thời làm giảm cả tốc độ phát triển trong môi trường nhân tạo và tính hung dữ (Bagirova và cộng sự, 2001; Stem, Kirk, 2004). Có lẽ đây là lý do tại sao trên thực tế không có chủng kháng thuốc nào trong số các chủng P. infestans tự nhiên, ngay cả những chủng thu thập từ các đồn điền khoai tây được xử lý bằng dimethomorph.
Một quần thể được xử lý bằng thuốc diệt nấm oligosite cũng sẽ bao gồm hai nhóm chủng: những chủng chưa tiếp xúc với thuốc diệt nấm và do đó không thay đổi các đặc điểm ban đầu (nếu tìm thấy các chủng kháng thuốc trong nhóm này, chúng sẽ không tích lũy do tính hiếu chiến và khả năng cạnh tranh cao hơn của các chủng nhạy cảm), và các chủng tiếp xúc với nồng độ sublethal của thuốc diệt nấm. Đó là một trong những cách sau đó là sự tích tụ của các chủng kháng thuốc là có thể xảy ra, bởi vì ở đây chúng có lợi thế hơn các chủng nhạy cảm.
Do đó, khi sử dụng thuốc trừ nấm oligosite không phải là điều trị triệt để mà quan trọng là nồng độ thuốc cao, cao hơn liều gây chết vài lần, vì khi gây đột biến từng bước thì khả năng kháng ban đầu của các chủng đột biến thấp.
Cuối cùng, đột biến về khả năng kháng thuốc diệt nấm monosite có tính biểu hiện cao, nghĩa là, một đột biến có thể báo cáo mức độ kháng thuốc cao đến mức mất hoàn toàn độ nhạy. Do đó, sự gia tăng sức đề kháng của quần thể xảy ra rất nhanh.
Một ví dụ về thuốc diệt nấm như vậy là phenylamit, bao gồm thuốc diệt nấm phổ biến nhất, metalaxyl. Các đột biến đề kháng với nó xuất hiện với tần suất cao, và mức độ đề kháng ở các thể đột biến là rất cao - nó vượt quá chủng nhạy cảm một phần nghìn trở lên (Derevyagina et al., 1993). Mặc dù tốc độ phát triển và tính hiếu chiến của các thể đột biến kháng thuốc giảm trong bối cảnh các chủng nhạy cảm bị chết do thuốc diệt nấm có hệ thống, nhưng số lượng quần thể kháng thuốc đang tăng nhanh và song song với đó, tính hiếu chiến của chúng cũng tăng lên. Do đó, sau vài năm sử dụng thuốc diệt nấm, tính hiếu chiến của các chủng kháng thuốc không những có thể ngang bằng với tính hiếu chiến của các chủng nhạy cảm mà còn vượt qua nó (Derevyagina, Dyakov, 1992).
Tác động đến tái tổ hợp giới tính
Vì sự xuất hiện thường xuyên của kiểu giao phối A2 trong quần thể P. infestans đồng thời với việc sử dụng thâm canh metalaxyl chống lại bệnh mốc sương, người ta cho rằng metalaxyl gây ra sự chuyển đổi kiểu giao phối. Ở P. parasitica, sự chuyển đổi như vậy dưới tác dụng của chloroneb và metalaxyl đã được chứng minh bằng thực nghiệm (Ko, 1994). Một đoạn truyền đơn lẻ trên môi trường có nồng độ metalaxyl thấp đã dẫn đến sự xuất hiện của các chủng đồng đẳng từ một dòng P. infestans nhạy cảm với metalaxyl với kiểu giao phối A1 (Savenkova và Cherepnikova-Anikina, 2002). Trong các lần truyền tiếp theo trên môi trường có nồng độ metalaxyl cao hơn, không phát hiện được một chủng nào của kiểu bắt cặp A2, tuy nhiên, hầu hết các chủng phân lập, khi lai với các chủng phân lập A2, thay vì bào tử, hình thành các tích tụ sợi nấm xấu xí và vô trùng. Các đoạn của một dòng kháng có kiểu giao phối A2 trên môi trường có nồng độ metalaxyl cao cho phép chúng tôi phát hiện ba dạng thay đổi kiểu giao phối: 1) vô sinh hoàn toàn khi lai với các chủng A1 và A2; 2) hiện tượng đồng phân tử (sự hình thành bào tử trong môi trường độc canh); 3) chuyển đổi kiểu giao phối A2 thành A1. Do đó, metalaxyl có thể gây ra những thay đổi trong kiểu giao phối trong quần thể P. infestans và do đó, sự tái tổ hợp hữu tính ở chúng xảy ra.
Ảnh hưởng đến tái tổ hợp sinh dưỡng
Một số gen kháng thuốc kháng sinh đã làm tăng tần số dị hợp đoạn sợi nấm và sự lưỡng bội hóa nhân (Poedinok và Dyakov, 1981). Như đã đề cập trước đó, hiện tượng dị phân tử của sợi nấm trong quá trình dung hợp các chủng P. infestans khác nhau xảy ra rất hiếm do hiện tượng bất tương hợp sinh dưỡng ở nấm này. Tuy nhiên, gen kháng một số loại kháng sinh có thể có tác dụng phụ, thể hiện ở việc khắc phục tình trạng không tương thích sinh dưỡng. Đặc tính này do gen kháng streptomycin đột biến 1S-1 sở hữu. Sự hiện diện của những đột biến như vậy trong quần thể thực vật có thể làm tăng dòng gen giữa các chủng và đẩy nhanh sự thích nghi của toàn bộ quần thể với các giống mới hoặc thuốc diệt nấm.
Một số loại thuốc diệt nấm và thuốc kháng sinh có thể ảnh hưởng đến tần số tái tổ hợp phân bào, cũng có thể làm thay đổi tần số kiểu gen trong quần thể. Benomyl diệt nấm được sử dụng rộng rãi liên kết với beta-tubulin, một loại protein mà từ đó các vi ống của bộ xương tế bào được xây dựng, và do đó làm gián đoạn quá trình phân tách nhiễm sắc thể trong giai đoạn sau của nguyên phân, làm tăng tần suất tái tổ hợp phân bào (Hastie, 1970).
Thuốc diệt nấm para-fluorophenylalanine, được sử dụng để điều trị bệnh Hà Lan ở cây du, cũng có tính chất tương tự. Para-fluorophenylalanin làm tăng tần số tái tổ hợp ở P. infestans lưỡng bội dị hợp tử (Poedinok và cộng sự, 1982).
Sự thay đổi theo chu kỳ thành phần kiểu gen của quần thể trong chu kỳ sống của P. infestans
Chu kỳ phát triển cổ điển của P. infestans ở đới ôn hòa bao gồm 4 giai đoạn.
1) Pha tăng trưởng theo cấp số nhân của quần thể (pha đa vòng) với các thế hệ ngắn. Giai đoạn này thường bắt đầu vào tháng 1,5 và kéo dài 2-XNUMX tháng.
2) Giai đoạn ngừng phát triển quần thể do tỷ lệ mô không bị ảnh hưởng giảm mạnh hoặc do điều kiện thời tiết bất lợi bắt đầu. Giai đoạn này ở các trang trại thực hiện việc loại bỏ lá trước khi thu hoạch sớm sẽ rơi ra khỏi chu kỳ hàng năm.
3) Giai đoạn chết đông ở củ, kèm theo sự giảm đáng kể kích thước quần thể do nhiễm trùng ngẫu nhiên của củ, sự phát triển chậm của nhiễm bệnh, không có sự tái nhiễm của củ, thối rữa và tiêu huỷ củ bị ảnh hưởng trong điều kiện bảo quản bình thường.
4) Giai đoạn phát triển chậm trong đất và trên cây con (giai đoạn đơn vòng), trong đó thời gian phát sinh có thể kéo dài một tháng hoặc hơn (cuối tháng XNUMX - đầu tháng XNUMX). Thông thường lúc này lá bị bệnh rất khó phát hiện dù có quan sát đặc biệt.
Giai đoạn tăng dân số theo cấp số nhân (giai đoạn đa vòng)
Nhiều quan sát (Pshedetskaya, Kozubova, 1969; Borisenok, 1969; Osh, 1969; Dyakov, Suprun, 1984; Rybakova, Dyakov, 1990) cho thấy rằng ở giai đoạn đầu của các loài vô tính biểu sinh, các dòng vô tính độc lực thấp và hơi hung hãn chiếm ưu thế, sau đó được thay thế bằng các dòng mạnh và hung hãn hơn. tốc độ phát triển tính hiếu chiến của quần thể càng cao thì giống cây chủ càng kém sức chống chịu.
Khi quần thể phát triển, nồng độ của cả hai gen quan trọng có chọn lọc được đưa vào các giống thương mại (R1-R4) và trung tính có chọn lọc (R5-R11) đều tăng lên. Vì vậy, trong các quần thể gần Moscow vào năm 1993, độc lực trung bình từ cuối tháng 8,2 đến giữa tháng 9,4 đã tăng từ 5 lên 31, và mức tăng lớn nhất được quan sát thấy đối với gen độc lực trung tính chọn lọc R86 (từ 1996 đến XNUMX% các dòng vô tính độc lực) (Smirnov, XNUMX ).
Tốc độ tăng trưởng của quần thể giảm đi kèm theo giảm hoạt động kí sinh của quần thể. Do đó, trong những năm suy thoái, cả tổng số chủng tộc và tỷ lệ các chủng tộc độc lực cao đều thấp hơn so với các chủng tộc biểu sinh (Borisenok, 1969). Nếu ở đỉnh cao của các điều kiện thời tiết biểu sinh thay đổi sang bất lợi cho bệnh mốc sương và sự xâm nhiễm của khoai tây giảm, thì mật độ của các dòng vô tính có độc lực cao và hiếu chiến cũng giảm (Rybakova et al., 1987).
Sự gia tăng tần số của các gen ảnh hưởng đến độc lực và tính hiếu chiến của quần thể có thể là do sự lựa chọn các dòng vô tính có độc lực và hiếu chiến hơn trong quần thể ngẫu phối. Để chứng minh sự chọn lọc, một phương pháp phân tích các đột biến trung tính đã được phát triển, được sử dụng thành công trong quần thể nấm men chemostat (Adams và cộng sự, 1985) và Fusarium graminearum (Wiebe và cộng sự, 1995).
Tần suất đột biến kháng với blasticidin S trong quần thể P. infestans giảm song song với sự tăng trưởng tính hung hăng của quần thể, điều này cho thấy sự thay đổi của các dòng trội trong quá trình tăng trưởng của quần thể (Rybakova et al., 1987).
Giai đoạn đông kết trong củ
Trong quá trình trú đông ở củ khoai tây, độc lực và tính hiếu chiến của các chủng P. infestans giảm, và sự giảm độc lực xảy ra chậm hơn tính hiếu chiến (Rybakova và Dyakov, 1990). Rõ ràng, trong những điều kiện có lợi cho sự phát triển nhanh chóng của kích thước quần thể (chọn lọc r), các gen độc lực "bổ sung" và tính hiếu chiến cao rất hữu ích, do đó, sự phát triển của biểu sinh đi kèm với việc chọn lọc những dòng vô tính độc và mạnh nhất. Trong điều kiện bão hòa của môi trường, khi không phải tốc độ sinh sản mà tính bền bỉ tồn tại trong điều kiện không thuận lợi (chọn lọc K) đóng vai trò quan trọng, các gen “phụ” của độc lực và tính hung hăng làm giảm thể lực, và các dòng vô tính với các gen này là dòng chết đầu tiên, do đó tính hung hăng trung bình độc lực của quần thể đang giảm.
Giai đoạn thực vật trong đất
Giai đoạn này là bí ẩn nhất trong vòng đời (Andrivon, 1995). Sự tồn tại của nó được công nhận hoàn toàn là suy đoán - do thiếu thông tin về những gì sẽ xảy ra với mầm bệnh trong một thời gian dài (đôi khi hơn một tháng) - từ khi cây khoai tây xuất hiện đến khi xuất hiện những nốt bệnh đầu tiên trên chúng. Trên cơ sở quan sát và thí nghiệm, hành vi của nấm trong thời kỳ sống này đã được tái tạo (Hirst và Stedman, 1960; Boguslavskaya, Filippov, 1976).
Sự phát sinh của nấm có thể hình thành trên các củ bị nhiễm bệnh trong đất. Kết quả là các bào tử nảy mầm với các sợi nấm, chúng có thể sinh sôi lâu dài trong đất. Bào tử sơ cấp (hình thành trên củ) và bào tử thứ cấp (trên sợi nấm trong đất) trồi lên bề mặt đất bằng các dòng mao dẫn, nhưng có khả năng lây nhiễm vào khoai tây chỉ sau khi lá dưới của nó hạ xuống và tiếp xúc với bề mặt đất. Những chiếc lá như vậy (cụ thể là những đốm bệnh đầu tiên được tìm thấy trên chúng) không hình thành ngay lập tức mà sau khi ngọn khoai tây sinh trưởng và phát triển kéo dài.
Do đó, giai đoạn thực vật sinh dưỡng cũng có thể tồn tại trong vòng đời của P. infestans. Nếu trong giai đoạn ký sinh của chu kỳ sống, tính hung hăng là thành phần quan trọng nhất của thể chất, thì trong giai đoạn sinh dưỡng, việc chọn lọc nhằm mục đích làm giảm các đặc tính ký sinh, như đã được chứng minh bằng thực nghiệm đối với một số loài nấm thực vật (xem Carson, 1993). Do đó, trong giai đoạn này của chu kỳ, các đặc tính tích cực sẽ bị mất đi nhiều nhất. Nhưng cho đến nay vẫn chưa có thí nghiệm trực tiếp nào được thực hiện để khẳng định các giả thiết trên.
Sự thay đổi theo mùa không chỉ ảnh hưởng đến đặc tính gây bệnh của P. infestans mà còn ảnh hưởng đến khả năng kháng thuốc diệt nấm, phát triển trong giai đoạn đa vòng (trong thời kỳ biểu sinh) và giảm trong quá trình bảo quản mùa đông (Derevyagina và cộng sự, 1991; Kadish và Cohen, 1992). Khả năng kháng metalaxyl đặc biệt giảm mạnh được quan sát thấy giữa việc trồng các củ bị ảnh hưởng và sự xuất hiện của các nốt bệnh đầu tiên trên đồng ruộng.
Chuyên môn hóa nội bộ và sự phát triển của nó
P. infestans đang gây dịch ở hai loại cây trồng quan trọng về thương mại là khoai tây và cà chua. Biểu sinh trên khoai tây bắt đầu ngay sau khi nấm xâm nhập vào các khu vực mới. Sự thất bại của cà chua cũng được ghi nhận ngay sau khi sự xuất hiện của bệnh nhiễm trùng trên khoai tây, nhưng biểu sinh trên cà chua đã được ghi nhận chỉ một trăm năm sau đó - vào giữa thế kỷ XNUMX. Đây là những gì Hallegli và Niederhauser viết về sự thất bại của cà chua ở Mỹ
(1962): “Trong khoảng 100 năm sau đợt biểu sinh nghiêm trọng năm 1845, rất ít hoặc hầu như không có nỗ lực nào được thực hiện để có được các giống cà chua kháng bệnh. Mặc dù bệnh mốc sương lần đầu tiên được ghi nhận trên cà chua vào đầu năm 1848, nhưng nó đã không trở thành đối tượng thu hút sự chú ý của các nhà lai tạo đối với loại cây này cho đến khi bệnh bùng phát mạnh vào năm 1946. Trên lãnh thổ của Nga, bệnh mốc sương của cà chua đã được đăng ký vào thế kỷ 60. “Trong một thời gian dài, các nhà nghiên cứu không chú ý đến căn bệnh này, vì nó không gây thiệt hại kinh tế đáng kể. Nhưng vào những năm 70 và 1979. Thế kỷ XX biểu sinh của bệnh mốc sương trên cà chua được quan sát thấy ở Liên Xô, chủ yếu ở vùng Hạ Volga, Ukraine, Bắc Caucasus, Moldova ... ”(Balashova, XNUMX).
Kể từ đó, bệnh mốc sương trên cà chua trở thành hàng năm, lan rộng ra toàn bộ lãnh thổ canh tác công nghiệp và gia đình và gây thiệt hại kinh tế to lớn cho cây trồng này. Chuyện gì đã xảy ra? Tại sao sự xuất hiện đầu tiên của ký sinh trùng trên khoai tây và vết bệnh trên biểu sinh của cây trồng này lại xảy ra gần như đồng thời, và tại sao phải mất một thế kỷ ký sinh mới xuất hiện trên cà chua? Những khác biệt này hỗ trợ một người Mexico hơn là một nguồn lây nhiễm Nam Mỹ. Nếu loài Phytophthora infestans hình thành như một loài ký sinh của các loài mang củ Mexico thuộc chi Solanum, thì có thể hiểu tại sao khoai tây trồng thuộc cùng một chi với loài Mexico lại bị ảnh hưởng mạnh mẽ như vậy, nhưng do không có sự đồng tiến hóa với ký sinh trùng, loài ký sinh này không phát triển các cơ chế kháng thuốc cụ thể và không đặc hiệu.
Cà chua thuộc một bộ phận khác của chi, kiểu trao đổi của nó có sự khác biệt đáng kể so với các loài có củ, do đó, mặc dù cà chua không nằm ngoài đặc sản thực phẩm của P. infestans, nhưng mức độ thiệt hại của nó không đủ để gây thiệt hại nghiêm trọng về kinh tế.
Sự xuất hiện của các biểu sinh trên cà chua là do những thay đổi nghiêm trọng về mặt di truyền của ký sinh trùng, làm tăng khả năng sinh sản (khả năng gây bệnh) của nó trong quá trình ký sinh. Chúng tôi tin rằng dạng mới chuyên dùng để ký sinh trên cà chua là chủng T1 do M. Gallegly mô tả, ảnh hưởng đến các giống cà chua bi (Red Cherry, Ottawa), kháng chủng T0 phổ biến trên khoai tây (Gallegly, 1952). Rõ ràng, một đột biến (hoặc một loạt đột biến) đã biến chủng T0 thành chủng tộc T1 và dẫn đến sự xuất hiện của các dòng vô tính thích nghi cao để đánh bại cà chua. Như thường xuyên xảy ra, sự gia tăng khả năng gây bệnh cho một vật chủ đi kèm với sự giảm cho nó cho một vật chủ khác, nghĩa là, một sự chuyên biệt hóa nội bộ ban đầu, chưa hoàn chỉnh đã phát sinh - đối với khoai tây (chủng tộc T0) và cà chua (chủng tộc T1).
Bằng chứng cho giả định này là gì?
- Xuất hiện trên khoai tây và cà chua. Trên lá cà chua, chủng tộc T1 chiếm ưu thế, còn trên lá khoai tây thì hiếm. Theo S.F.Bagirova và T.A. Oreshonkova (chưa được công bố) ở vùng Moscow trong năm 1991-1992, sự xuất hiện của chủng tộc T1 trong trồng khoai tây là 0%, và trong trồng cà chua - 100%; năm 1993-1995 lần lượt là 33% và 90%; năm 2001 - 0% và 67%. Dữ liệu tương tự cũng được thu thập ở Israel (Cohen, 2002). Các thí nghiệm về sự lây nhiễm của củ khoai tây với các chủng phân lập của chủng T1 và hỗn hợp các chủng phân lập T0 và T1 cho thấy rằng các chủng phân lập của chủng T1 được bảo quản kém trong củ và được thay thế bằng các phân lập của chủng T0 (Dyakov và cộng sự, 1975; Rybakova, 1988).
2) Động thái của chủng tộc T1 trong trồng cà chua. Sự lây nhiễm sơ cấp trên lá cà chua được thực hiện bởi các chủng T0, chủng này chiếm ưu thế trong phân tích sự lây nhiễm ở những đốm đầu tiên hình thành trên lá. Điều này khẳng định sơ đồ di cư của ký sinh trùng thường được chấp nhận: Khối lượng lây nhiễm chính từ khoai tây là do chủng tộc T0 tạo ra, tuy nhiên, một số lượng nhỏ các dòng T1 được bảo tồn trong khoai tây, một khi trên cà chua, sẽ thay thế chủng tộc T0 và tích lũy vào cuối thời kỳ biểu sinh. Cũng có thể có nguồn lây nhiễm lá cà chua thay thế bằng nòi T1, tuy không mạnh bằng củ và lá khoai tây nhưng không đổi. Do đó, nguồn này có ảnh hưởng yếu đến cấu trúc di truyền của quần thể nhiễm cà chua, nhưng sau đó quyết định sự tích lũy của nòi T1 (Rybakova, 1988; Dyakov và cộng sự, 1994).
3) Tính gây hại đối với khoai tây và cà chua. Sự lây nhiễm nhân tạo trên lá cà chua và khoai tây với các chủng phân lập của chủng T0 và T1 cho thấy chủng tộc trước đây hung dữ hơn đối với khoai tây hơn là đối với cà chua, và chủng loại thứ hai thì hung dữ hơn đối với cà chua so với khoai tây. Những khác biệt này được thể hiện trong sự dịch chuyển của các chủng phân lập của một chủng tộc không phải “riêng” từ một quần thể hỗn hợp trong quá trình chuyển lá trong nhà kính (D'yakov và cộng sự, 1975) và trong các thửa ruộng (Leberton và cộng sự, 1999); sự khác biệt về tải lượng lây nhiễm tối thiểu, thời gian tiềm ẩn, kích thước của các điểm lây nhiễm và sản sinh bào tử (Rybakova, 1988; Dyakov và cộng sự, 1994; Legard và cộng sự, 1995; Forbes và cộng sự, 1997; Oyarzun và cộng sự, 1998; Leberton và cộng sự. cộng sự, 1999; Vega-Sanchez và cộng sự, 2000; Knapova, Gisi, 2002; Sussuna và cộng sự, 2004).
Tính hiếu chiến của các chủng phân lập của chủng T1 đối với các giống cà chua thiếu gen kháng bệnh cao đến mức các phân lập này bào tử trên lá như trên môi trường dinh dưỡng mà không làm hoại tử mô bị nhiễm (Dyakov và cộng sự, 1975; Vega-Sanchez và cộng sự, 2000).
4) Chống độc cho khoai tây và cà chua. Nòi T1 ảnh hưởng đến các giống cà chua anh đào có gen kháng Ph1, trong khi nòi T0 không có khả năng lây nhiễm các giống này, tức là có độc lực hẹp hơn. Liên quan đến các yếu tố khác biệt
Các gen R của khoai tây có quan hệ nghịch đảo, tức là các chủng phân lập từ lá cà chua ít độc lực hơn các chủng “khoai tây” (Bảng 11).
5) Các điểm đánh dấu trung tính. Việc phân tích các dấu hiệu trung tính trong quần thể P. infestans ký sinh trên khoai tây và cà chua cũng chứng minh cho sự chọn lọc nội đặc hiệu đa hướng. Trong quần thể P. infestans ở Brazil, các dòng phân lập từ lá cà chua thuộc dòng vô tính US-1, và các dòng từ lá khoai tây thuộc dòng BR-1 (Suassuna và cộng sự, 2004). Ở Florida (Mỹ), từ năm 1994, dòng US-90 bắt đầu chiếm ưu thế trên khoai tây (với tỷ lệ xuất hiện hơn 8%), và dòng US-11 và US-17 trên cà chua, và các dòng phân lập sau này gây hại cho cà chua hơn khoai tây (Weingartner , Tombolato, 2004). Sự khác biệt đáng kể về tần số kiểu gen (dấu vân tay DNA) ở khoai tây và cà chua phân lập được đối với 1200 chủng P. infestans được thu thập tại Hoa Kỳ từ năm 1989 đến 1995 (Deahl và cộng sự, 1995).
Sử dụng phương pháp AFLP có thể tách được 74 chủng thu thập từ lá khoai tây và cà chua vào năm 1996-1997. ở Pháp và Thụy Sĩ, trong 7 nhóm. Các chủng khoai tây và cà chua không có sự khác biệt rõ ràng, nhưng các chủng "khoai tây" đa dạng hơn về mặt di truyền so với các chủng "cà chua". Nhóm thứ nhất được tìm thấy trong tất cả bảy cụm, và nhóm thứ hai, chỉ trong bốn cụm, điều này cho thấy một bộ gen chuyên biệt hơn của nhóm sau (Knapova và Gisi, 2002).
6) Cơ chế phân lập. Nếu các quần thể ký sinh trên hai loài thực vật ký chủ tiến triển theo hướng thu hẹp chuyên môn hóa đối với vật chủ “của riêng mình”, thì các cơ chế tiền và hậu sinh học khác nhau phát sinh ngăn cản sự trao đổi gen giữa các quần thể (Dyakov và Lekomtseva, 1984).
Một số nghiên cứu đã khảo sát ảnh hưởng của nguồn dòng bố mẹ đến hiệu quả của phép lai. Khi lai các chủng phân lập từ các loài khác nhau của chi Solanum ở Ecuador (Oliva và cộng sự, 2002), người ta thấy rằng các chủng có kiểu giao phối A2 từ họ Solanaceae hoang dã (dòng vô tính EC-2) là lai kém nhất với các chủng từ cà chua (dòng EC -3), và được lai hiệu quả nhất với dòng khoai tây (EC-1).
Tất cả các giống lai đều không gây bệnh. Các tác giả cho rằng tỷ lệ lai thấp và giảm khả năng gây bệnh ở con lai là do cơ chế cách ly sinh sản của quần thể sau sinh học.
Trong các thí nghiệm của Bagirova và cộng sự (1998), một số lượng lớn các chủng khoai tây và cà chua đã được lai với các đặc tính của chủng T0 và T1. Các phép lai có khả năng sinh sản cao nhất của các chủng T1xT1 được phân lập từ cà chua (36 bào tử trứng trong trường nhìn bằng kính hiển vi, 44% nảy mầm bào tử), kém hiệu quả nhất là các phép lai của các chủng tộc T0xT1 được phân lập từ các vật chủ khác nhau (số lượng bào tử đang phát triển và nảy mầm thấp, tỷ lệ cao bào tử bào thai chết và kém phát triển) ... Hiệu quả của phép lai giữa các chủng T0 phân lập từ khoai tây là trung gian. Vì cơ thể chính của các chủng thuộc chủng T0 ảnh hưởng đến khoai tây, nó có một nguồn trú đông đáng tin cậy - củ khoai tây, do đó tầm quan trọng của bào tử trứng như là đơn vị lây nhiễm mùa đông đối với quần thể từ khoai tây là thấp. “Dạng cà chua” thích nghi có thể tạo đông trên cà chua ở dạng bào tử (xem bên dưới) và do đó giữ được năng suất cao hơn của quá trình hữu tính. Do khả năng sinh sản cao, T1 có được khả năng lây nhiễm sơ cấp độc lập ở cà chua. Kết quả thu được bởi Knapova và cộng sự (Knapova và cộng sự, 2002) có thể được giải thích theo cách tương tự. Phép lai giữa các chủng phân lập từ khoai tây với các chủng từ cà chua cho số lượng bào tử cao nhất - 13,8 trên mỗi sq.mm. trung bình (với mức lây lan từ 5-19) và tỷ lệ phần trăm trung gian của sự nảy mầm của bào tử (6,3 với mức lây lan từ 0-24). Phép lai giữa các chủng được phân lập từ cà chua cho tỷ lệ bào tử thấp nhất (7,6 với mức lây lan từ 4-12) với tỷ lệ nảy mầm cao nhất (10,8). Phép lai giữa các chủng phân lập từ khoai tây cho số lượng bào tử trung gian (8,6 với dữ liệu phân tán cao - 0-30) và tỷ lệ tế bào trứng nảy mầm thấp nhất (2,7). Do đó, các chủng từ khoai tây kém sinh sản hơn so với các chủng từ cà chua, nhưng các phép lai giữa các quần thể không cho kết quả tồi tệ hơn so với các phép lai giữa các quần thể. Có thể là sự khác biệt với dữ liệu trên của Bagirova et al. được giải thích là do các nhà nghiên cứu Nga đã làm việc với các chủng được phân lập vào đầu những năm 90 của thế kỷ XX, và các nhà nghiên cứu Thụy Sĩ - với các chủng được phân lập vào cuối những năm 90.
Cơ sở cho khả năng sinh sản thấp có thể là sự dị bội của các chủng. Nếu ở các quần thể Mexico, nơi quá trình sinh dục và lây nhiễm sơ cấp với con cái diễn ra thường xuyên, hầu hết các chủng P. Infestans được nghiên cứu là lưỡng bội, thì ở các quốc gia thuộc Thế giới cổ đa bội được quan sát thấy (các chủng di-, tri- và tứ bội, cũng như các chủng dị nhân có nhân dị bội) và các chủng có các kiểu giao phối khác nhau, tức là khả năng sinh sản lẫn nhau, khác nhau về dị bội hạt nhân (Therrien et al., 1989, 1990; Whittaker et al., 1992; Ritch, Daggett, 1995). Sự đa dạng của nhân ở antheridia và oogonia có thể là lý do cho khả năng sinh sản thấp.
Đối với sự trao đổi hạt nhân giữa các sợi nấm trong quá trình nối tiếp, điều này bị ngăn cản bởi sự không tương thích về mặt sinh dưỡng, chia tách các quần thể vô tính thành nhiều dòng vô tính được phân lập về mặt di truyền (Poedinok và Dyakov, 1987; Gorbunova và cộng sự, 1989; Anikina và cộng sự, 1997b).
7) Sự quần tụ của quần thể. Dữ liệu trên chỉ ra rằng có thể lai giữa các chủng P. infestans "khoai tây" và "cà chua". Cũng có thể tái nhiễm các vật chủ khác nhau, mặc dù tính hung hăng đã giảm.
Một nghiên cứu về các dấu hiệu quần thể trong các chủng phân lập từ các ruộng khoai tây và cà chua liền kề vào năm 1993 cho thấy rằng khoảng một phần tư các chủng phân lập từ lá cà chua được chuyển từ ruộng khoai tây lân cận (Dolgova et al., 1997). Về mặt lý thuyết, có thể giả định rằng sự khác biệt giữa các quần thể trên hai vật chủ sẽ tăng lên và dẫn đến sự xuất hiện của các dạng đặc hiệu chuyên biệt (khoai tây và cà chua), đặc biệt là vì bào tử trứng có thể tồn tại trong các mảnh vụn thực vật (Drenth và cộng sự, 1995 ; Bagirova, Dyakov, 1998) và hạt cà chua (Rubin và cộng sự, 2001). Do đó, cà chua hiện có nguồn tái sinh mùa xuân không phụ thuộc vào củ khoai tây.
Tuy nhiên, mọi thứ đã diễn ra khác. Quá đông với bào tử cho phép ký sinh trùng tránh được giai đoạn hẹp nhất trong vòng đời của nó - giai đoạn đơn vòng của thảm thực vật trong đất, trong đó các đặc tính ký sinh giảm dần, chúng dần dần được phục hồi trong giai đoạn đa vòng vào mùa hè.
Bảng 11. Tần suất của các gen độc lực đối với các giống khoai tây khác biệt ở các chủng P. infestans
nước | Năm | Số lượng gen độc lực trung bình trong các chủng | Tác giả | |
từ khoai tây | từ cà chua | |||
Pháp | 1995 | 4.4 | 3.3 | Leberton và cộng sự, 1999 |
1996 | 4.8 | 3.6 | Leberton, Andrivon, 1998 | |
Pháp, Thụy Sĩ | 1996-97 | 6.8 | 2.9 | Knapova, Gisi, 2002 |
Hoa Kỳ | 1989-94 | 5 | 4.8 | Goodwin và cộng sự, 1995 |
Hoa Kỳ, Zap. Washington | 1996 | 4.6 | 5 | Dorrance và cộng sự, 1999 |
1997 | 6.3 | 3.5 | " | |
Ecuador | 1993-95 | 7.1 | 1.3 | Oyarzun và cộng sự, 1998 |
Israel | 1998 | 7 | 4.8 | Cohen, 2002 |
1999 | 6 | 5.7 | " | |
2000 | 6.7 | 6.1 | " | |
Nga, Mosk. khu vực | 1993 | 8.9 | 6.7 | Smirnov, 1996 |
Nga, các khu vực khác nhau | 1995 | 9.4 | 8 | Kozlovskaya và những người khác. |
1997 | 9.2 | 9.2 | " | |
2000 | 8.7 | 4.8 | " |
Động vật bào tử sơ cấp và bào tử động vật nảy mầm bào tử, có mức độ hoạt động ký sinh cao, đặc biệt nếu bào tử được hình thành di truyền một phần dưới ảnh hưởng của pheromone của một dòng có kiểu giao phối ngược lại. Do đó, vật liệu lây nhiễm trên cây giống cà chua trồng từ hạt bị nhiễm bào tử trùng có khả năng gây bệnh cao cho cả cà chua và khoai tây.
Những thay đổi này đã dẫn đến một sự tái cơ cấu dân số khác, thể hiện qua những thay đổi quan trọng sau đây theo quan điểm dịch tễ học:
- Cây giống cà chua bị nhiễm bệnh đã trở thành nguồn lây nhiễm chính quan trọng cho khoai tây (Filippov, Ivanyuk, thông điệp cá nhân).
- Sự biểu sinh trên khoai tây bắt đầu được quan sát thấy sớm nhất là vào tháng XNUMX, sớm hơn bình thường khoảng một tháng.
- Trong trồng khoai tây, tỷ lệ chủng tộc T1, trước đây đã gặp ở đó với số lượng không đáng kể, đã tăng lên (Ulanova và cộng sự, 2003).
- Các chủng phân lập từ lá cà chua không còn khác biệt với các chủng khoai tây về độc lực trên các bộ phân biệt gen độc lực của khoai tây và bắt đầu vượt qua các chủng “khoai tây” về tính hiếu chiến không chỉ trên cà chua mà còn trên khoai tây (Lavrova và cộng sự, 2003; Ulanova và cộng sự. , 2003).
Vì vậy, thay vì phân kỳ, đã có sự hội tụ của các quần thể, sự xuất hiện của một quần thể duy nhất trên hai cây chủ có độc lực cao và gây hấn với cả hai loài.
Kết luận
Vì vậy, mặc dù hơn 150 năm nghiên cứu chuyên sâu về P. infestans, trong sinh học, bao gồm cả sinh học quần thể của tác nhân gây bệnh quan trọng nhất của cây họ đậu này, vẫn chưa được biết nhiều. Người ta không rõ việc trải qua các giai đoạn riêng lẻ của chu kỳ sống ảnh hưởng đến cấu trúc của quần thể như thế nào, cơ chế di truyền của sự biến đổi tính hiếu chiến và độc lực là gì, tỷ lệ của hệ thống sinh sản vô tính và sinh sản vô tính trong quần thể tự nhiên như thế nào, tính bất tương hợp sinh dưỡng được di truyền như thế nào, vai trò của khoai tây và cà chua trong sự lây nhiễm sơ cấp của những cây trồng này và ảnh hưởng của chúng đến cấu trúc quần thể của ký sinh trùng. Cho đến nay, các vấn đề thực tế quan trọng như cơ chế di truyền để thay đổi tính hiếu chiến của ký sinh trùng hoặc sự xói mòn của tính kháng không đặc hiệu của khoai tây vẫn chưa được giải quyết. Với việc đào sâu và mở rộng nghiên cứu về bệnh mốc sương ở khoai tây, ký sinh trùng đặt ra những thách thức mới cho các nhà nghiên cứu. Tuy nhiên, sự cải thiện khả năng thực nghiệm, sự xuất hiện của các phương pháp tiếp cận mới để thao tác với gen và protein cho phép chúng ta hy vọng vào một giải pháp thành công cho các câu hỏi được đặt ra.
Bài đã đăng trên tạp chí “Bảo vệ khoai tây” (số 3 năm 2017)