D. Yu. Ryazantsev, E. M. Chudinova, L. Yu. Kokaeva, S. N. Elansky, P. N. Balabko, G. L. Belova, S. K. Zavriev
Loại nấm thực vật Colletotrichum coccodes gây ra các bệnh nguy hiểm trên khoai tây và cà chua gọi là bệnh thán thư và bệnh đốm đen củ. Bởi đặc điểm hình thái, chúng thường khó phân biệt với các bệnh do vi sinh vật khác gây ra; trên quả cà chua xanh, bệnh có thể không có triệu chứng, chỉ biểu hiện trên quả chín đỏ. Để chẩn đoán nhanh chóng và chính xác mầm bệnh, hệ thống xét nghiệm PCR thời gian thực được cung cấp. Để phát triển một hệ thống thử nghiệm, trình tự nucleotide của gen glycerol triphosphate dehydrogenase của 45 chủng C. coccodes phân lập từ củ khoai tây ở các vùng khác nhau của Nga đã được xác định.
Dựa trên kết quả thu được và phân tích trình tự tương tự của các loài khác có trong cơ sở dữ liệu GenBank, các mồi và mẫu dò dành riêng cho loài C. coccodes đã được thiết kế. Để kiểm tra tính đặc hiệu của hệ thống thử nghiệm đã tạo, PCR được thực hiện với DNA được phân lập từ các mẫu cấy thuần khiết của 15 loài nấm ký sinh và sinh dưỡng khác nhau có liên quan đến cây cà chua và cây khoai tây (Fusarium oxysporum, F. verticillium, Phomopsis phaseoli, Alternaria Alternata, Helminthosporium solani, Colletotrichum coccodes Phellinus ferrugineovelutinus, Stemphylium vesicarium, Helminthosporium solani, Phomopsis phaseoli, Neonectria radicicola, Rhizoctonia solani, Penicillium sp., Cladosporium fulvum, C. cladosporioides). Sự hiện diện của DNA Colletotrichum coccodes được xác định ở chu kỳ ngưỡng 20–27, trong khi các loài khác được phát hiện sau 40 chu kỳ hoặc không được phát hiện. Hệ thống xét nghiệm có thể phát hiện một cách đáng tin cậy C. coccodes DNA nồng độ vượt quá 0.01 ng / mm3 trong hỗn hợp PCR được phân tích. Sử dụng hệ thống thử nghiệm đã phát triển, nghiên cứu sự hiện diện của C. coccodes trong lá cà chua với các triệu chứng bệnh nấm và trong củ khoai tây không có các triệu chứng bên ngoài của bệnh. Những lá có triệu chứng nhiễm nấm được thu thập từ hai cánh đồng khác nhau ở vùng Krasnodar, củ - từ những cánh đồng ở vùng Kostroma, Moscow, Kaluga, Nizhny Novgorod. Một lá cà chua chứa DNA của C. coccodes được tìm thấy ở Lãnh thổ Krasnodar; Sự hiện diện đáng kể của DNA của mầm bệnh này đã được phát hiện trong 5 mẫu củ trồng ở vùng Kostroma, Moscow, Kaluga.
Giới thiệu
Nấm thuộc giống Colletotrichum là những phytopathogens nguy hiểm ảnh hưởng đến ngũ cốc, rau, thảo mộc, cây ăn quả lâu năm và quả mọng. Một trong những loài phổ biến của chi này, Colletotrichum coccodes (Wallr).
Hughes, là tác nhân gây bệnh thán thư và bệnh đốm đen trên khoai tây và cà chua, gây bệnh cho một số cây khác thuộc họ Solanaceae, bao gồm cả. cỏ dại (Dillard, 1992). C. coccodes ảnh hưởng đến tất cả các bộ phận dưới đất của cây, gốc thân, lá và quả (Andrivon et al., 1998; Johnson, 1994). Trên vỏ của củ khoai tây bị nhiễm bệnh có thể quan sát thấy sự phát triển của các đốm màu xám với các mép không rõ ràng, trên đó có thể nhìn thấy rõ các chấm đen dạng bào tử và hạt nhỏ. Trong quá trình bảo quản, các vết loét có thành phần bị mềm có thể hình thành trong cùi của củ, tức là Tuy nhiên, căn bệnh này chuyển sang giai đoạn thán thư.
Đồng thời, các triệu chứng bệnh thán thư (vết loét trên da có chấm đen nhỏ) đặc trưng trên quả cà chua. Trên lá, các triệu chứng của C. coccodes xuất hiện như những đốm màu nâu sẫm, thường có viền mô màu vàng (Johnson, 1994).
Sự phát triển của đốm đen trên củ làm hỏng vẻ ngoài của chúng, điều này đặc biệt rõ ràng khi bán khoai tây vỏ đỏ đã rửa sạch. Tẩy da chết dẫn đến bay hơi quá mức và tăng thất thoát lưu trữ (Hunger, McIntyre, 1979). Thiệt hại đối với các cơ quan khác của thực vật dẫn đến mất năng suất, điều này đã được ghi nhận ở cả đất trống và đất kín (Johnson, 1994; Tsror et al., 1999). Bệnh do C. coccodes gây ra phổ biến ở hầu hết các vùng sản xuất khoai tây trên thế giới, bao gồm cả Nga (Leesa, Hilton, 2003; Belov và cộng sự, 2018). Việc kiểm soát những bệnh này rất khó khăn do không có đủ hiệu quả của các loại thuốc trừ nấm hiện có đối với C. coccodes và thiếu các giống kháng bệnh (Read, Hide, 1995).
Chất cấy C. coccodes có thể tồn tại trong củ giống (Read, Hide, 1988; Johnson et al., 1997), hạt cà chua (Ben-Daniel et al., 2010), tồn tại lâu dài trong đất, trên mảnh vụn thực vật (Dillard, 1990) ; Dillard, Cobb, 1993) và trong cỏ dại (Raid, Pennypacker, 1987). Các công trình của một số tác giả (Read, Hide, 1988; Barkdoll, Davis, 1992; Johnson et al., 1997; Dillard, Cobb, 1993) đã chỉ ra rằng sự phát triển của bệnh trên khoai tây và cà chua phần lớn phụ thuộc vào sự hiện diện của chất cấy trong hạt và đất. Do đó, để giảm thiểu thiệt hại do bệnh gây ra, cần phải chẩn đoán (bao gồm cả định lượng) mầm bệnh của nấm trong vật liệu giống, trong đất, trong củ giống khoai tây và hạt cà chua để bảo quản. Việc chẩn đoán hình thái trong đất và vật liệu thực vật chỉ có thể được thực hiện khi có sự hiện diện của vi nấm, tuy nhiên, chúng cũng được tìm thấy ở các loại nấm khác.
Các triệu chứng trên củ rất giống với bệnh vảy bạc do nấm Helminthosporium solani gây ra. Việc phân lập Colletotrichum coccodes và Helminthosporium solani thành một môi trường nuôi cấy thuần là khá khó khăn và mất nhiều thời gian do sự phát triển chậm trên môi trường dinh dưỡng. Để xác định nhanh các mã Colletotrichum, cần sử dụng các phương pháp chẩn đoán bằng dụng cụ. Phương pháp thuận tiện nhất là phản ứng chuỗi polymerase (PCR) và biến đổi của nó - PCR thời gian thực. Hiện tại, một hệ thống thử nghiệm do các nhà nghiên cứu Anh (Cullen và cộng sự, 2002) phát triển cho vùng ITS1 của rDNA được sử dụng ở Châu Âu và Hoa Kỳ. Việc sử dụng nó đã cho thấy kết quả tốt trong việc phân tích các chủng Nga (Belov và cộng sự, 2018). Tuy nhiên, C. coccodes rất thay đổi và việc phát hiện nó từ một chuỗi DNA có thể dẫn đến kết quả âm tính giả. Để chẩn đoán đáng tin cậy hơn, cần phải phân tích một số trình tự DNA đặc trưng cho loài, liên quan đến chúng tôi đã phát triển một hệ thống xét nghiệm ban đầu cho phép xác định C. coccodes bằng trình tự của gen glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase.
Nguyên liệu và phương pháp
Để đánh giá hiệu quả và tính đặc hiệu của các hệ thống thử nghiệm đã tạo, chúng tôi sử dụng mẫu cấy thuần chủng của 15 loài nấm do các tác giả phân lập từ các mẫu lá, quả cà chua, củ khoai tây bị bệnh (Bảng 1). Để phân lập, các cơ quan của cây có triệu chứng nhiễm nấm được lấy, không quá một cơ quan trên mỗi bụi.
Một lát củ có vỏ, một lát quả cà chua và một chiếc lá bị bệnh được đặt dưới kính hiển vi hai mắt, sau đó sợi nấm, bào tử hoặc một mảnh mô được chuyển lên môi trường thạch (wort agar) trong đĩa Petri với một kim mổ được mài sắc. Các chủng phân lập được bảo quản trên thạch nghiêng trong các ống nghiệm ở 4 ° C.
Các mẫu lá cà chua có triệu chứng nấm bệnh dùng để phân tích ngay sau khi thu hái (tại hiện trường) được cho vào cồn etylic 70% để bảo quản cho đến khi phân lập được ADN. Củ khoai tây được chuyển đến phòng thí nghiệm, bóc vỏ (miếng 2 × 1 cm) và đông lạnh ở –20 ° С. Bảo quản đông lạnh cho đến khi phân lập được DNA.
Các mẫu nấm thuần chủng để phân lập DNA được nuôi trong môi trường hạt đậu lỏng. Sợi nấm được tách ra khỏi môi trường lỏng, làm khô trên giấy lọc, đông lạnh trong nitơ lỏng, đồng nhất, ủ trong đệm CTAB, tinh chế bằng cloroform, kết tủa bằng hỗn hợp isopropanol và 0.5M kali axetat, và rửa hai lần bằng cồn 2%. DNA thu được được hòa tan trong nước khử ion và được bảo quản ở –70 ° С (Kutuzova et al., 20). Nồng độ DNA được đo bằng bộ định lượng DNA HS cho DNA sợi kép trên Qubit 2017 (Qiagen, Đức). Các mẫu đông lạnh và cồn hóa được nghiền nhỏ trong nitơ lỏng, sau đó tiến hành tách chiết DNA như đã mô tả ở trên (đối với sợi nấm của các mẫu cấy nấm tinh khiết).
Bảng 1. Nguồn gốc của các chủng nấm được sử dụng
Tên nấm | Thực vật, nội tạng | Nơi lựa chọn |
---|---|---|
Colletotrichum cocodes 1, C. cocodes 2, C. cocodes 3, Ilyonectria crassa, Rhizoctonia solani | củ khoai tây | Vùng Kostroma, củ khoai tây thế hệ 1, giống Red Scarlett |
Coccodes Colletotrichum 4 | lá khoai tây | Đại diện Mari El, Yoshkar-Ola |
Helminthosporium solani | củ khoai tây | Vùng Magadan, pos. Lều, củ khoai tây |
Điểm tựa Cladosporium | lá cà chua | Vùng Matxcova, cà chua quả lớn |
Alternaria cà chua | quả cà chua | do cán bộ phòng thí nghiệm nấm và bệnh thực vật thuộc Viện nghiên cứu bảo vệ thực vật toàn Nga đệ trình |
Fusarium verticillium, Phomopsisphaseoli, Alternaria Alternata, Phellinus ferrugineovelutinus, Stemphylium vesicarium, Cladosporium cladosporioides, Acrodontium luzulae, Penicillium sp. | quả cà chua | Lãnh thổ Krasnodar, quận Krymsky, cấp độ Kem |
Fusarium oxysporum | củ mì | Khu vực Moscow |
PCR được thực hiện trên bộ khuếch đại DTprime (Công nghệ DNA). Đối với PCR, mồi gốc và mẫu dò tìm vùng đặc trưng cho loài của gen glycerol triphosphat dehydrogenase được sử dụng: mồi thuận Coc70gdf –TCATGATATCATTTCTCTCACGGCA, mồi ngược Coc280gdr - TACTTGAGCATGTAGGCCTGGGT1. Các đoạn mồi khuếch đại một vùng 213 bp.
Phản ứng thu được 50 ng DNA tổng số (trong phân tích lá và củ) và 10 ng (trong phân tích DNA của các mẫu nấm thuần chủng). Hỗn hợp phản ứng (35 μl) được tách bởi một lớp parafin thành hai phần: phần dưới (20 μl) chứa 2 μl dung dịch đệm phản ứng 10 × (750 mM Tris-HCl, pH 8.8; 200 mM (NH4) 2SO4; 25 mM MgCl2; 0.1% Tween- 20), 0.5 mM của mỗi deoxynucleotide triphosphat, 7 pmol của mỗi mồi, và 4 pmol của một đầu dò huỳnh quang có thể thủy phân; cái trên chứa 1 μl đệm PCR 10 × và 1 U Taq polymerase.
Việc tách hỗn hợp bằng parafin cho phép các ống được bảo quản trong thời gian dài ở nhiệt độ 5 ° C và tạo ra sự khởi đầu nóng của PCR sau khi nung chúng trong 10 phút ở nhiệt độ trên 80 ° C. PCR được thực hiện theo chương trình sau: 94.0 ° C - 90 s (1 chu kỳ); 94.0 ° C - 30 giây; 64.0 ° C - 15 s (5 chu kỳ); 94.0 ° C - 10 giây; 64.0 ° C - 15 s (45 chu kỳ); 10.0 ° C - bảo quản.
kết quả và thảo luận
Trình tự của gen glycerol triphosphat dehydrogenase được xác định trong 45 chủng phân lập từ lá, thân, củ khoai tây và quả cà chua (Kutuzova, 2018) ở các vùng khác nhau của Nga. Trình tự nghiên cứu của tất cả các chủng được chia thành 2 nhóm khác nhau về hai nucleotide. Trình tự nucleotit của các đại diện của cả hai nhóm dưới các số KY496634 và KY496635 được gửi vào Ngân hàng GenBank.
Các mồi coc70gdf, coc280gdr và đầu dò cocgdz được thiết kế trên cơ sở của chúng đã được kiểm tra bằng chương trình BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) trên tất cả các trình tự của gen glycerol triphosphat dehydrogenase của các loài thuộc chi Colletotrichum và các sinh vật khác có trong cơ sở dữ liệu GenBank.
Không tìm thấy vùng DNA của các sinh vật khác có độ tương đồng cao với mồi và mẫu dò.
Độ nhạy của hệ thống thử nghiệm được kiểm tra bằng cách sử dụng các mẫu có nồng độ khác nhau của DNA C. coccodes, DNA của lá khoai tây bị nhiễm bệnh thán thư (thu thập năm 2017 ở Mari El, giống Red Scarlett), và vỏ củ bị bệnh đốm đen (thu thập ở vùng Kostroma, giống Red Scarlett, Bảng 2). Để xác nhận sự hiện diện của DNA trong củ và lá khoai tây, các chủng C. coccodes đã được phân lập từ chúng vào môi trường nuôi cấy tinh khiết.
Kết quả phân tích độ nhạy của hệ thống xét nghiệm cho thấy nó có thể được sử dụng để chẩn đoán thành công sự hiện diện của C. coccodes DNA trong mẫu khi tổng hàm lượng của nó trong hỗn hợp PCR lớn hơn 0.05 ng. Điều này là khá đủ để phát hiện, vì trung bình một hạch nấm chứa 0.131 ng và một bào tử chứa khoảng 0.04 ng DNA (Cullen et al., 2002). Hệ thống thử nghiệm do nhóm người Anh phát triển (Cullen và cộng sự, 2002) cho thấy độ nhạy tương tự (ngưỡng chu kỳ 34 ở 0.05 ng DNA và 37 ở 0.005 ng).
Việc phân tích các mẫu tự nhiên có chứa C. coccodes trong mọi trường hợp có thể cho thấy sự hiện diện của nó trong mẫu một cách đáng tin cậy (Bảng 2). Phương pháp đề xuất để phân lập DNA cũng có thể áp dụng cho việc phân tích các mẫu thực vật tự nhiên.
Bảng 2. Xác định độ nhạy của hệ thống thử nghiệm được đề xuất để xác định các mã Colletotrichum cho PCR thời gian thực
Образец | Lượng DNA trong mẫu *, ng | Chu kỳ ngưỡng | C. phát hiện mã hóa |
---|---|---|---|
Mã hóa sợi nấm Colletotrichum | 50 | 21.3 | + |
5 | 25.7 | + | |
0.5 | 29,7 | + | |
0.05 | 33.5 | + | |
0.005 | 40 | - | |
0.0005 | 42.8 | - | |
0.00005 | - | ||
Vỏ củ 1 | 50 | 32 | + |
Vỏ củ 2 | 50 | 30 | + |
Vỏ củ 3 | 50 | 31.5 | + |
Lá khoai tây | 50 | 29.5 | + |
Ghi chú. * Trong hỗn hợp sản phẩm PCR.
Tính đặc hiệu của hệ thống thử nghiệm được kiểm tra trên các mẫu DNA chiết xuất từ 15 loài nấm. Tất cả các chủng nấm đều được các tác giả phân lập từ quả, lá khỏe mạnh của cà chua, củ khoai tây; một dòng được phân lập từ củ lúa mì (Bảng 1). Trong số các loài được phân lập từ bề mặt của quả, có cả những loài không gây bệnh cho cà chua (ví dụ: Phellinus ferrugineovelutinus).
Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng DNA của C. coccodes được phát hiện ở chu kỳ ngưỡng 20–27, trong khi các loài nấm khác không được phát hiện hoặc cho tín hiệu sau chu kỳ 40, điều này có thể là do hiệu ứng nhiễu không đặc hiệu (Bảng 3).
Bảng 3. Kiểm tra hệ thống kiểm tra các loại nấm
Tên nấm | Chu kỳ ngưỡng |
Mã hóa Colletotrichum 1 | 20.9 |
C. mã hóa 2 | 22.6 |
C. mã hóa 3 | 23 |
C. mã hóa 4 | 22 |
Fusarium oxysporum | > 40 |
F. verticalillium | > 40 |
Rhizoctonia solani | > 40 |
Phomopsis phaoli | > 40 |
Alternaria Alternata | > 40 |
A. cà chua | > 40 |
Helminthosporium solani | > 40 |
Phellinus ferrugineoveutinus | > 40 |
Thân cây vesicarium | > 40 |
Ilyonectria crassa | > 40 |
Cladosporium cladosporioides | > 40 |
C. điểm tựa | > 40 |
Acrodontium luzulae | > 40 |
Penicillium sp. | > 40 |
Ghi chú. * Số lượng DNA trong tất cả các mẫu là 10 ng.
Hệ thống thử nghiệm đã phát triển được sử dụng để xác định C. coccodes trong các mẫu lá cà chua có các triệu chứng của mầm bệnh hoại sinh và củ giống khoai tây không có triệu chứng rõ ràng. Đối với nghiên cứu, chúng tôi đã lấy củ giống của các giống khác nhau được trồng ở các vùng Kostroma, Moscow, Kaluga, Nizhny Novgorod. Sự hiện diện của DNA C. coccodes được coi là có ý nghĩa trong các mẫu phân tích mà chu kỳ ngưỡng không vượt quá 35. Giá trị ngưỡng này được chọn dựa trên việc xác định đáng tin cậy 0.05 ng DNA của C. coccodes (ngưỡng chu kỳ 33.5, Bảng 2) và thực tế là ngưỡng chu kỳ trên 40, DNA không đặc hiệu của một số loài nấm khác đã được chẩn đoán. Với cách tiếp cận này, sự hiện diện đáng kể của DNA C. coccodes đã được phát hiện trong 5 mẫu củ được trồng ở các vùng Kostroma, Moscow, Kaluga và trên một lá cà chua ở quận Yeisk của vùng Krasnodar (Bảng 4, 5).
Bảng 4. Phát hiện coccodes Colletotrichum trên củ khoai tây *
Số mẫu | Khoai tây đa dạng | Nơi tăng trưởng | C. phát hiện mã hóa | Chu kỳ ngưỡng |
---|---|---|---|---|
1 | Red Scarlet | Vùng bá đạo | + | 35 |
2 | + | 35 | ||
3 | - | 38 | ||
4 | Sante | Khu vực Moscow | + | 34 |
5 | - | |||
6 | - | 41 | ||
7 | - | 41.8 | ||
8 | + | 30 | ||
9 | Zhukovsky sớm | Khu vực Moscow | - | 40.5 |
10 | - | 40.6 | ||
11 | - | |||
12 | Molly | Vùng Kaluga | + | 34.3 |
13 | - | 38.4 | ||
14 | Ảo tưởng | Vùng Kaluga | - | |
15 | Gala | Nizhny Novgorod khu vực. | - | |
16 | - |
Ghi chú. * Số lượng DNA trong tất cả các mẫu là 50 ng.
Bảng 5. Phát hiện coccodes Colletotrichum trên lá cà chua *
Số mẫu | Nơi tăng trưởng | C. phát hiện mã hóa | Chu kỳ ngưỡng |
---|---|---|---|
1 | Lãnh thổ Krasnodar, Quận Crimean | - | |
2 | - | ||
3 | - | ||
4 | - | 45 | |
5 | - | ||
6 | - | ||
7 | - | ||
8 | - | ||
9 | Lãnh thổ Krasnodar, Quận Yeisk | - | 39.2 |
10 | - | 40.8 | |
11 | - | ||
12 | - | 41.6 | |
13 | - | 40 | |
14 | - | 41 | |
15 | - | 41.9 | |
16 | - | ||
17 | - | ||
18 | - | 40.3 | |
19 | - | ||
20 | - | ||
21 | + | 34.5 | |
22 | - | ||
23 | - |
* Số lượng DNA trong tất cả các mẫu là 50 ng.
Hệ thống thử nghiệm do chúng tôi tạo ra không thua kém hệ thống thử nghiệm được phát triển bởi các nhà nghiên cứu Anh (Cullen và cộng sự, 2002) về độ nhạy và độ đặc hiệu và phù hợp cho việc phân tích các mẫu thực vật. Ứng dụng của nó trong việc phân tích củ giống đã làm cho nó có thể xác định được DNA của C. coccodes trong củ mà không có dấu hiệu hư hỏng bên ngoài và phân tích thành công sự lây nhiễm của lá.
Cho đến nay, chưa có phân tích củ khoai tây nào về sự xâm nhập của C. coccodes ở Nga. Nghiên cứu đầu tiên của chúng tôi cho thấy trong số 16 củ giống được thử nghiệm trồng ở các vùng khác nhau của Liên bang Nga, 5 củ chứa C. coccodes. Điều này cho thấy bệnh đốm đen trên củ khoai tây là một bệnh khoai tây phổ biến ở Nga, và vai trò của nó trong việc giảm khối lượng và chất lượng khoai tây bị đánh giá thấp.
Phân tích lá cà chua cho thấy sự hiện diện đáng kể của DNA C. coccodes trong một lá ở quận Yeisk của Lãnh thổ Krasnodar. Trước đó, khi kiểm tra các ruộng cà chua ở miền nam nước Nga bằng hệ thống thử nghiệm của Anh (Cullen và cộng sự, 2002), lá có chứa C. coccodes đã được tìm thấy, và ở một số ruộng, tỷ lệ lá bị nhiễm C. coccodes đã được tìm thấy (Belov và cộng sự, 2018). Tại Lãnh thổ Krasnodar và Primorsky, Vùng Matxcova, chúng tôi đã tìm thấy những quả cà chua, từ đó chúng tôi đã tìm cách phân lập các mẫu cấy thuần chủng C. coccodes. Có thể C. coccodes phổ biến trên cà chua ở Nga hơn nhiều so với người ta vẫn nghĩ, và tác hại của nó cũng bị đánh giá thấp.
Vì vậy, cho đến nay, đã có đủ thông tin về sự phân bố rộng rãi của C. coccodes trên khoai tây và cà chua.
Để hiểu rõ hơn về vai trò của loại nấm này đối với sự phát triển của bệnh hại khoai tây và cà chua, cần theo dõi sự phổ biến của chúng ở Nga, nghiên cứu vai trò của bệnh nhiễm trùng đất và hạt giống, và vai trò của bệnh đốm đen đối với tổn thất trong quá trình bảo quản. Việc sử dụng chẩn đoán PCR có thể tạo thuận lợi đáng kể cho công việc này, và việc sử dụng đồng thời cả hai hệ thống xét nghiệm sẽ làm tăng đáng kể độ chính xác của phép phân tích.
Công trình này được hỗ trợ bởi Quỹ Khoa học Nga số 18-76-00009.
Bài báo đã đăng trên tạp chí “Mycology and Phytopathology” (tập 54, số 1, năm 2020).