ĂN. Chudinov, V.A. Platonov, A.V. Alexandrova, S.N. Elansky
Gần đây người ta đã chỉ ra rằng nấm ascomycete Ilyonectria crassa có khả năng lây nhiễm vào củ khoai tây. Đây là công trình đầu tiên phân tích các đặc điểm sinh học và khả năng kháng một số loại thuốc trừ nấm của chủng I. crassa phân lập từ khoai tây. Trình tự của các vùng cụ thể theo loài của chủng “khoai tây” trùng khớp với trình tự thu được trước đó đối với nấm được phân lập từ rễ của hoa thủy tiên vàng, nhân sâm, cây dương và cây sồi, củ hoa loa kèn và lá tulip. Rõ ràng, nhiều loài thực vật hoang dã và vườn có thể là nguồn dự trữ của I. crassa. Chủng nghiên cứu đã nhiễm vào các lát cà chua và khoai tây, nhưng không nhiễm vào toàn bộ quả cà chua và củ khoai tây nguyên vẹn. Điều này cho thấy I. crassa là ký sinh trùng vết thương. Đánh giá khả năng kháng fludioxonil, difenoconazole và azoxystrobin trên môi trường dinh dưỡng cho thấy hiệu quả cao của các thuốc này.
Chỉ số EC50 (nồng độ thuốc diệt nấm làm chậm tốc độ phát triển của khuẩn lạc bằng 2 lần so với đối chứng không dùng thuốc diệt nấm) bằng 0.4; 7.4 và 4 mg / l, tương ứng. Cần tính đến khả năng phát triển của bệnh do I. crassa gây ra khi đánh giá thực vật học của củ khoai tây và xây dựng các biện pháp bảo vệ thực vật.
Sự phát triển của vi sinh vật phytopathogenic dẫn đến thất thoát cao ở tất cả các giai đoạn trồng và bảo quản khoai tây. Thông thường, khi lập kế hoạch các biện pháp bảo vệ, các mầm bệnh nổi tiếng được tính đến, chẳng hạn như các loài thuộc các chi Alternaria, Fusarium, Phoma, Helminthosporium, Colletotrichum, Phytophthora, v.v. Tuy nhiên, trong những năm gần đây, ngày càng có nhiều báo cáo về sự xuất hiện của các vi sinh vật gây bệnh mới trên khoai tây. Sinh học của chúng chưa được nghiên cứu kỹ lưỡng, hiệu quả của thuốc diệt nấm được sử dụng trên khoai tây liên quan đến chúng chưa được biết rõ, các phương pháp chẩn đoán chưa được phát triển. Với sự phát triển hàng loạt, chúng có khả năng gây hại đáng kể cho vụ khoai tây. Một trong những vi sinh vật này là nấm ascomycete Ilyonectria crassa (Wollenw.) A. Cabral & Crous, được các tác giả phát hiện lần đầu trên củ khoai tây (Chudinova và cộng sự, 2019).
Công trình này trình bày kết quả phân tích chủng I. crassa được phân lập từ củ khoai tây. Hình thái của khuẩn lạc và cấu trúc sợi nấm của I. crassa, trình tự nucleotide của các vùng DNA đặc trưng cho loài, độc lực đối với khoai tây và cà chua, và khả năng kháng một số loại thuốc trừ nấm phổ biến đã được nghiên cứu.
Nguyên liệu và phương pháp
Chúng tôi đã sử dụng chủng I. crassa 18KSuPT2 được phân lập vào năm 2018 từ củ khoai tây bị ảnh hưởng được trồng ở vùng Kostroma. Củ bị ảnh hưởng bởi một loại bệnh thối khô với một khoang được bao phủ bởi sợi nấm màu nâu nhạt. Sử dụng kim bóc tách vô trùng, sợi nấm được chuyển vào đĩa Petri với môi trường thạch (dịch bia 10%, thạch 1.5%, penicillin 1000 U / ml). Các đĩa được ủ trong bóng tối ở 24 ° C.
Kính hiển vi ánh sáng Leica DM2500 với máy ảnh kỹ thuật số ICC50 HD và kính hiển vi hai mắt Leica M80 với máy ảnh kỹ thuật số IC80HD (Leica Microsystems, Đức) được sử dụng để chụp ảnh, đánh giá kích thước và hình thái của bào tử và cơ quan bào tử.
Để phân lập DNA, sợi nấm được nuôi trong môi trường hạt đậu lỏng, sau đó được đông lạnh trong nitơ lỏng, đồng nhất, ủ trong đệm CTAB, tinh chế bằng cloroform, và rửa hai lần bằng cồn 2%.
Phương pháp tách chiết DNA được mô tả chi tiết trong bài báo của Kutuzova et al. (2017).
Để xác định loài bằng phương pháp phân tử và so sánh với các chủng I. crassa đã biết khác, PCR được thực hiện với các đoạn mồi cho phép khuếch đại các vùng DNA đặc trưng cho loài: ITS1-5,8S-ITS2 (primer ITS5 / ITS4, White et al., 1990), các vùng gen b -tubulin (Bt2a / Bt2b, Glass, Donaldson, 1995) và hệ số kéo dài dịch mã 1α (tef1α) (mồi EF1-728F / EF1-986R, Carbone và Kohn, 1999). Amplicon có độ dài mong muốn được chiết xuất từ gel bằng bộ Evrogen CleanUp. Các vùng khuếch đại được giải trình tự bằng cách sử dụng Bộ giải trình tự chu kỳ BigDye® Terminator v3.1 (Hệ thống sinh học ứng dụng, CA, Hoa Kỳ) trên bộ giải trình tự tự động Hệ thống sinh học ứng dụng 3730 xl (Hệ thống sinh học ứng dụng, CA, Hoa Kỳ). Các trình tự nucleotide thu được được sử dụng để tìm kiếm sự trùng khớp trong cơ sở dữ liệu GenBank của Trung tâm Thông tin Công nghệ Sinh học Quốc gia Hoa Kỳ (NCBI). Phân tích phát sinh loài được thực hiện bằng chương trình MEGA 6 (Tamura và cộng sự, 2013).
Việc xác định độc lực được thực hiện trên toàn bộ quả xanh của cà chua quả lớn (giống Dubrava) và củ khoai tây (giống Gala). Ngoài ra, để mô phỏng hư hỏng của các loại quả và củ bị hư, chúng tôi đã sử dụng các lát cắt của các loại quả và củ giống nhau. Các lát củ được đặt trong các buồng ẩm, là các đĩa Petri có lót giấy lọc ướt ở đáy. Trên giấy được đặt một slide, trên đó đặt các lát củ hoặc quả. Toàn bộ củ, quả cũng được cho vào thùng có lót giấy lọc ướt ở đáy. Ở trung tâm của lát cắt (hoặc trên bề mặt nguyên vẹn của củ hoặc quả), một miếng thạch (5 x 5 mm) có sợi nấm được đặt sau 5 ngày nuôi cấy trên thạch tảo.
Việc đánh giá khả năng kháng thuốc diệt nấm của các chủng nấm được thực hiện trong điều kiện phòng thí nghiệm trên môi trường thạch dinh dưỡng. Chúng tôi đã nghiên cứu tính mẫn cảm với các loại thuốc trừ nấm Maxim, KS (hoạt chất fludioxonil, 25 g / l), Quadris, KS (azoxystrobin 250 g / l), Scor, EC (difenoconazole 250 g / l) (Danh mục nhà nước ..., 2020). Đánh giá được thực hiện trong đĩa Petri trên môi trường thạch có bổ sung các loại thuốc được khảo sát ở nồng độ của hoạt chất 0.1; một; 1 ppm (mg / L) (đối với fludioxonil và difenoconazole), 10; mười; 1 ppm (đối với azoxystrobin) và trong môi trường không có thuốc diệt nấm (đối chứng). Thuốc diệt nấm được thêm vào môi trường nấu chảy và làm lạnh đến 10 ° C, sau đó môi trường được đổ vào đĩa Petri. Một khối thạch có sợi nấm được đặt vào giữa đĩa Petri và được nuôi cấy ở nhiệt độ 100 ° C trong bóng tối. Sau 60 ngày ủ, đường kính của khuẩn lạc được đo theo hai hướng vuông góc với nhau; kết quả đo cho mỗi khuẩn lạc được lấy trung bình. Các thí nghiệm được thực hiện trong ba lần. Dựa trên kết quả phân tích, EC24 đã được tính toán, bằng với nồng độ thuốc diệt nấm, làm giảm một nửa tốc độ phát triển hướng tâm của thuộc địa so với đối chứng diệt nấm.
kết quả và thảo luận
Trên đĩa petri có thạch wort, nấm hình thành các khuẩn lạc có sợi nấm mọng nước màu trắng. Môi trường dưới sợi nấm chuyển sang màu nâu đỏ. Khi môi trường khô đi, nấm hình thành bào tử gồm hai loại trên tế bào đơn bào và tập hợp trong bào tử bào nhỏ. Macroconidia dài, hình trụ, có một đến ba vách ngăn, chiều dài trung bình 27.2 µm với phạm vi giá trị từ 23.2 đến 32.2 µm, chiều rộng - lên đến 4.9 µm (Hình 1). Chiều dài trung bình của vi bào tử là 14.3 µm với dải giá trị từ 10.3 đến 18.1 µm, chiều rộng lên đến 4.0 µm. Tất cả các đặc điểm vĩ mô và vi hình đều phù hợp với phạm vi biến thể của loài Ilyonectria crassa (Cabral và cộng sự, 2012).
Trình tự của các vùng DNA đặc trưng cho loài (ITS, b-tubulin, TEF 1α) hoàn toàn trùng khớp với trình tự của các chủng I. crassa mà chúng tôi đã nghiên cứu trước đó (Chudinova et al., 2019, Bảng 1). Để nghiên cứu sự phổ biến của I. crassa ở các khu vực khác và để phân tích phổ của các nền văn hóa bị ảnh hưởng, trình tự DNA tương tự trong cơ sở dữ liệu GenBank đã được phân tích (Bảng 1). Độ trùng lặp là 86 đến 100%. Trình tự của cả ba vùng DNA của chủng "khoai tây" I. crassa giống với trình tự của các chủng được phân lập từ củ huệ và rễ thủy tiên ở Hà Lan và từ củ nhân sâm ở Canada. Chúng tôi không thể tìm thấy các chủng I. crassa khác với ba trình tự tương tự được phân tích trong cơ sở dữ liệu mở. Tuy nhiên, phân tích trình tự ITS và b-tubulin lắng đọng cho thấy sự hiện diện của I. crassa trên lá tulip ở Anh. Các loại nấm có trình tự ITS tương tự đã được xác định khi phân tích mycobiota của rễ cây dương lan ở Canada và rễ cây sồi ở Ý, và củ khoai tây ở Ả Rập Xê Út (Bảng 1). Kết quả của nghiên cứu này cho thấy I. crassa có phân bố toàn cầu và có khả năng lây nhiễm sang các loài thực vật khác nhau.
Khi xác định khả năng gây bệnh trên các lát cà chua, khoai tây ở ngày thứ 5, đường kính vết bệnh đạt 1.5 cm, chủng điều tra không nhiễm vào cả quả cà chua và nguyên củ khoai tây. Tuy nhiên, các lá đài đã bị ảnh hưởng trên cà chua. Để loại trừ khả năng nhiễm bẩn, một chủng nấm phân lập từ sợi nấm phát triển trên một lát củ khoai tây đã được phân lập thành môi trường nuôi cấy thuần khiết. Nó hoàn toàn giống với dòng bố mẹ. Rõ ràng, I. crassa là một loại ký sinh trùng vết thương.
Xử lý củ giống trước khi trồng bằng thuốc trừ nấm làm giảm sự phát triển của bệnh trên cây trong mùa sinh trưởng. Để lựa chọn các loại thuốc diệt nấm hiệu quả, điều quan trọng là phải đánh giá loại nào trong số chúng có hiệu quả đối với I. сrassa. Công trình đã nghiên cứu các chất hoạt động rộng rãi của thuốc diệt nấm - fludioxonil, azoxystrobin, difenoconazole. Fludioxonil được bao gồm trong một số hỗn hợp được sử dụng để trộn hạt giống và củ giống trước khi trồng. Fludioxonil (Maxim) cũng được sử dụng để xử lý củ giống trước khi bảo quản. Difenoconazole và azoxystrobin cũng được bao gồm trong một số chế phẩm được sử dụng để xử lý vật liệu hạt giống, cũng như trong các chế phẩm dành cho chế biến cây sinh dưỡng (Danh mục nhà nước ..., 2020).
Tốc độ phát triển của I. crassa được nghiên cứu trên môi trường (Hình 2) với các nồng độ hoạt chất khác nhau: fludioxonil (EC50 = 0.4 ppm), azoxystrobin (EC50 = 4 ppm), và difenoconazole (EC50 = 7.4 ppm) (Bảng 2). Các chế phẩm này có thể được coi là có hiệu quả cao đối với I. crassa, vì EC50 của chúng thấp hơn đáng kể so với nồng độ khuyến cáo của chế phẩm trong dung dịch xử lý củ. Theo Danh mục Nhà nước ... (2020), nồng độ fludioxonil trong chất lỏng để xử lý củ khoai tây là từ 500 đến 1000 ppm, azoxystrobin (trong chất lỏng để xử lý đáy rãnh) - 3750-9375 ppm, difenoconazole (trong chất lỏng để xử lý cây sinh dưỡng) - 187.5– 625 ppm.
Bảng 1. Sự giống nhau về trình tự của các trình tự cụ thể theo loài của chủng 18KSuPT2 và các chủng Ilyonectria crassa có trong cơ sở dữ liệu Ngân hàng gen
Sự căng thẳng, quá tải | Cây ký chủ, nơi bài tiết | Số thứ tự gửi vào GenBank, tỷ lệ phần trăm tương tự | Liên kết | ||
ITS | β-tubulin | TEF 1α | |||
17KSPT1 và 18KSuPT2 | Củ khoai tây, vùng Kostroma | MH818326 | MH822872 | MK281307 | Chudinova và cộng sự, 2019, công việc này |
CBS158/31 | Rễ cây thủy tiên, Hà Lan | JF735276 100 | JF735394 100 | JF735724 99.3 | Cabral và cộng sự, 2012 |
CBS139/30 | Củ huệ, Hà Lan | JF735275 100 | JF735393 99.7 | JF735723 99.3 |
|
NSAC-SH-1 | Rễ nhân sâm, Canada | AY295311 99.4 | JF735395 100 | JF735 / 725 99.6 |
|
RHS235138 | Tulip lá, Vương quốc Anh | KJ475469 100 | KJ513266 100 | ND | Denton, Denton, 2014 |
MT294410 | Rễ Aspen, Canada | MT294410 100 | ND | ND | Ramsfield và cộng sự, 2020 |
ER1937 | Beech, Ý | KR019363 99.65 | ND | ND | Tizzani, Haegi, Motta. Nộp trực tiếp |
KAUF19 | Củ khoai tây, Ả Rập Xê Út | HE649390 98.3 | ND | ND | Gashgari, Gherbawy, 2013 |
ND = không ký gửi
Bảng 2. Khả năng kháng thuốc diệt nấm của Ilyonectria crassa
(hoạt chất) | EC50, ppm | ||||
ngày 3 | ngày 5 | ngày 7 | |||
Kiểm soát | 17 2 ± | 33 5 ± | 47 3 ± | ||
Quadris, KS (fsoxystrobin) | 18 1 ± | 34 2 ± | 48 2 ± | ||
11 1 ± | 11 1 ± | 12 1 ± | |||
11 1 ± | 11 1 ± | 12 1 ± | |||
Maxim, KS (fludioxonil) | 16 1 ± | 28 2 ± | 48 2 ± | ||
7 1 ± | 13 3 ± | 19 4 ± | |||
5 1 ± | 12 1 ± | 17 5 ± | |||
Skor, EC (difenoconazole) | 18 1 ± | 35 2 ± | 48 1 ± | ||
11 1 ± | 24 3 ± | 35 4 ± | |||
11 1 ± | 13 1 ± | 17 3 ± |
Trong nghiên cứu của chúng tôi, các chủng I. crassa đã được phân lập từ củ khoai tây ở vùng Kostroma và Moscow (Chudinova et al., 2019). Một tỷ lệ cao các chủng nấm có trình tự ITS giống với I. crassa đã được phát hiện khi phân tích mycobiota của củ khoai tây ở Ả Rập Xê Út (Gashgari và Gherbawy, 2013). Rõ ràng, I. crassa không hiếm trên khoai tây như người ta tưởng. Thí nghiệm của chúng tôi cho thấy nấm có thể lây nhiễm sang trái cà chua bị hư hỏng. Các tài liệu đã biết rằng I. crassa có khả năng phát triển trong đất một cách sa dưỡng (Moll et al., 2016), cũng như ảnh hưởng đến nhiều loại thực vật, thậm chí cả những loài xa nhau về mặt phân loại như hoa thủy tiên, hoa loa kèn, nhân sâm, cây dương và cây sồi (Bảng 1). một). Rõ ràng, nhiều loài thực vật hoang dã và vườn có thể là nguồn dự trữ của I. crassa. Những điều trên cho thấy khi xây dựng các biện pháp bảo vệ cần phải tính đến khả năng ảnh hưởng đến củ khoai bằng loại nấm này. Các chế phẩm rộng rãi để xử lý củ khoai tây có chứa fludioxonil, azoxystrobin, và difenoconazole đã cho thấy hiệu quả diệt nấm cao đối với I. crassa.
Công trình này được hỗ trợ bởi Quỹ Nghiên cứu Cơ bản của Nga (Khoản tài trợ số 20-016-00139).
Bài báo đã đăng trên tạp chí "Plant Protection Bulletin", 2020, 103 (3)